杜鹃基因组微卫星富集文库地构建.docVIP

杜鹃基因组微卫星富集文库的构建-农学论文 杜鹃基因组微卫星富集文库的构建 王书珍，金卫斌，项俊，郑永良，方元平，干建平，程华，杜航 （经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室／黄冈师范学院生命科学学院，湖北黄冈　４３８０００） 摘要：利用ＦＩＡＳＣＯ方法（Ｆａｓｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＡＦＬＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＣＯｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｓ）构建杜鹃（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｉｍｓｉｉ Ｐｌａｎｃｈ.）的（ＡＧ）ｎ微卫星富集文库。通过菌液ＰＣＲ检测，从（ＡＧ）ｎ微卫星富集文库的３５６个阳性菌落中筛选了２３３个进行测序分析。结果表明，２０２个序列富含ＳＳＲ位点，阳性比率达８６．７％。去除杂峰、叠峰、信号弱的序列，最终筛选３９个供后续引物开发使用，其中完美型ＳＳＲ有２２个，不完美型５个，混合型１２个。磁珠富集法构建杜鹃基因组微卫星文库是一条高效可行的途径，为微卫星位点的分离、杜鹃种群遗传多样性和遗传结构的研究奠定了基础。 关键词 ：杜鹃（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｉｍｓｉｉ Ｐｌａｎｃｈ．）；微卫星；探针；富集文库 中图分类号：Ｓ６８５．２１；Ｑ３４３．１文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）03－0６２７-0４ 杜鹃花（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｐｐ．）泛指杜鹃花科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）杜鹃花属（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏn）植物，具有极高的观赏价值，并被誉为“花中西施”和“木本花卉之王”［１，２］。杜鹃花在亚洲、欧洲、北美洲等地广泛分布，并且因气候条件不同而垂直分布明显，从而形成了常绿大乔木、常绿小乔木、常绿灌木、落叶灌木等不同形态特征的地理居群［３］。杜鹃花兼有美学观赏、生态保护、药用治疗、科学研究等价值［１］。杜鹃花属近１ ０００种，中国有５７１种，其中特有种多达４００多个［４］。在中国，云南、西藏、四川三省（自治区）交汇处的横断山脉是世界杜鹃花的发源地和分布中心［５］。近几年来，在气候变化与人类活动日渐加剧的大背景下，杜鹃花的种质资源也受到不同程度的影响，甚至出现退化现象。因此，亟须对现有的杜鹃花资源进行科学的评价，并制定切实可行的遗传保护策略。 微卫星（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ），又称简单重复序列（Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ），是以１～６ ｂｐ核苷酸为重复单位且均匀分布于生物基因组中的串联重复序列。微卫星标记因其分布广泛、多态性强、信息含量丰富、遗传稳定性好、共显性遗传等特点，而被广泛应用于作物的遗传结构分析、遗传育种、图谱构建、基因定位、亲缘关系分析及种质资源鉴定等研究中［６－９］。Ｎａｉｔｏ等［１０］率先从Ｒ． ｍｅｔｔｅｒｎｉｃｈｉｉ基因组内开发了ＳＳＲ分子标记。Ｔａｎ等［１１］从 Ｒ． ｓｉｍｓｉｉ 基因组内开发了８个ＳＳＲ标记。Ｗａｎｇ等［１２］从Ｒ． ｄｅｃｏｒｕｍ基因组内开发了２４个微卫星标记。Ｗａｎｇ 等［１３］从 Ｒ． ｄｅｌａｖａｙｉ 和 Ｒ． ｄｅｃｏｒｕｍ基因组内开发了３８对ＳＳＲ引物，其中９对可以跨物种扩增。Delmas等［14］Ｃｈａｒｒｉｅｒ等［１５］用４５４ 焦磷酸测序技术从Ｒ． ｆｅｒｒｕｇｉｎｅｕｍ基因组内开发了１８个微卫星标记。 现有的ＳＳＲ标记难以满足对杜鹃花种群的遗传变异特征、基因流、种群进化历史、遗传图谱构建等研究中对微卫星标记数量的需求。因此，本研究以（ＡＧ）ｎ为探针构建杜鹃花特有种杜鹃（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｓｉｍｓｉｉ Ｐｌａｎｃｈ．）的基因组微卫星富集文库，旨在为杜鹃花群体遗传学分析、遗传图谱构建、花期性状基因的关联分析、ＱＴＬ定位等研究提供高效的ＳＳＲ标记。 １材料与方法 １．１材料 １．１．１材料来源杜鹃样品取自湖北省麻城市龟峰山山顶“杜鹃花王”的幼嫩叶片。样品采集后置于自封袋内，并放入冰盒中，带回实验室置－８０ °Ｃ冰箱备用。 １．１．２试剂ＤＮＡ限制性内切酶ＭｓｅＩ、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶购自ＮＥＢ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）。Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰｓ均购天根生物公司。链霉亲和素磁珠Ｍ－２８０试剂盒（Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，１１２－０５Ｄ）、磁珠收集器（Ｄｙｎａｌ ＭＰＣ，１２３－２０Ｄ）购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ。克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ购于ＴａＫａＲａ，转化用的大肠杆菌ＴＯＰ１０感受态细胞由经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室保存。ＡＦＬＰ接头序列Ｏｌｉｇｏ－ＭｓｅＩ－Ａ（５′－ＴＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ－３′）和Ｏｌｉｇｏ－ＭｓｅＩ－Ｂ（５′－ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧ－３′）由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。生物素标记的（ＡＧ）ｎ探针由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ