雷公藤甲素通过抗ER磷酸化抑制小鼠4T1乳腺癌增殖的作用的研究.docVIP

雷公藤甲素通过抗ER磷酸化抑制小鼠4T1乳腺癌增殖的作用的研究 　　[摘要] 雷公藤甲素（triptolide，TP）具有显著的抑制肿瘤作用。本研究采用MTT法和结晶紫染色法检测TP对小鼠乳腺癌细胞4T1增殖的影响；流式细胞仪检测TP诱导的4T1细胞凋亡率；Western blot检测4T1中相关蛋白雌激素受体α（estrogen reporter α，ERα），磷酸化ERα（p-ERα），ERβ，p-ERβ，细胞外信号调节的蛋白激酶（ERK），p-ERK，p38，p-p38，c-Jun氨基末端激酶（SAPK/JNK），p-SAPK/JNK的表达。给药30 d后，活体荧光示踪技术观察TP对4T1-Luc细胞接种的BALB/c 雌性小鼠乳腺癌的荧光强度，同时检测肿瘤体积和质量，计算抑瘤率。肿瘤组织苏木素-伊红（HE）染色后观察病理变化；免疫组织化学法（IHC）分析肿瘤组织ERα及ERβ的表达情况。发现TP体外浓度为100，10，1，0.1 μmol?L-1时可显著抑制4T1乳腺癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡。TP剂量为200 μg?kg-1时能抑制小鼠乳腺癌的增殖，TP的抗乳腺癌增殖作用与降低ERα，ERβ的磷酸化密切相关，但与MAPK通路的活化无明显相关性。 　　[关键词]雷公藤甲素；小鼠4T1乳腺癌细胞；抑制增殖；雌激素受体；活体荧光示踪 　　传统中药雷公藤具有多种药理作用[1]，研究表明雷公藤有很好的抗肿瘤活性[2]，主要抗肿瘤有效成分是雷公藤甲素（triptolide，TP）。众多研究表明TP是一种广谱肿瘤抑制剂，对乳腺癌[3]、T细胞淋巴瘤[4-5]、肝细胞癌[6-7]、肺癌[8]、胰腺癌[9]、前列腺癌[10]等多种肿瘤具有抑制作用，其中以直肠癌细胞株HCT 116和乳腺癌细胞株MCF-7最为敏感。许多研究资料表明，内源性或外源性雌激素水平与乳腺癌的发生、发展密切相关[10-12]。细胞膜及胞浆上的雌激素受体（estrogen receptor，ER）与雌激素结合后产生效应，靶器官不同，所产生的作用也不同，取决于体内各个不同组织中ER的含量[13]。本课题拟研究雷公藤甲素对小鼠乳腺癌细胞4T1增殖的影响，并进一步研究雌激素受体的活化水平与雷公藤甲素抗乳腺癌细胞增殖的可能作用机制。 　　1材料 　　1.1细胞株与动物 小鼠乳腺癌细胞株4T1及荧光素酶标记的4T1-Luc细胞由美国芝加哥大学何通川教授惠赠。细胞用DMEM 完全培养基（含10%胎牛血清、青霉素1×105 U?L-1、链霉素100 mg?L-1），在37 ℃、饱和湿度及5%CO2的细胞培养箱内培养，每1～2 d传代1 次。整个实验过程中用台盼蓝染色实验检测细胞活性。雌性BALB/c小鼠，体重18～22 g，60只。许可证号SCXK（沪）2008-0016，SPF级，购于上海西普尔必凯实验动物有限公司。 　　1.2试剂 TP（上海同田生物技术股份有限公司，纯度≥98%，批；阳性对照药阿霉素（浙江省肿瘤医院，批号0QL0073）；DMEM高糖培养液，0.25% Trypsin，0.02% EDTA，0.25% 胰酶溶液（吉诺生物医药技术有限公司）；噻唑蓝（MTT），二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）；0.4% 台盼蓝溶液，高效RIPA组织/细胞裂解液（Solarhio）；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I（BD Pharmingen）；ERα（C-311），p-ERα（Ser118），ERβ（H-150），p-ERβ（Ser87）（Santa Cruz公司）；MAPK Family Antibody Sampler Kit，Phospho-MAPK Family Antibody Sampler Kit（Cell Signaling）；Streptavidin Herseradish Peroxidase Conjugated（Thermo scientific）；Chemiluminescent detection reagent（advansta）；牛血清白蛋白（BSA）、磷酸盐缓冲液（PBS）、BCA蛋白浓度测定试剂盒、Actin抗体（β-actin）、生物素标记山羊抗兔IgG（H+L）二抗、生物素标记山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗、改进型抗原修复液（碧云天生物技术研究所）；DAB-Puffertabletten（默克公司）。苏木精-伊红（HE）染液（南京建成生物工程研究所）。 　　1.3仪器 荧光倒置显微镜（OLYMPUS）；转移电泳槽（上海天能科技有限公司）；酶联免疫检测仪（美国Bio-TeR，美国）；化学发光成像仪（北京赛智创业科技有限公司）；XENOGEN IVIS