生物化学课件（杨洋）17重组dna技术教学材料.pptVIP

重组DNA技术;一、克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿主细胞等 ;质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。;配伍末端（compatible end）：不同限制性内切酶产生的相同粘性末端 ;质粒的特点： 1、环状DNA，2kb～数百kb。 2、某些质粒可以重组到染色体中复制。; 松弛性质粒，拷贝数多，不受细胞内染色体控制。;The constructed plasmid pBR322 ;An example of an E. coli expression vector. ;噬菌体载体 ; 2、M13 噬菌体 单链DNA，用于DNA序列分析、体外定点突变;其它类型载体 ;其它类型载体 ;一、限制----修饰体系（restriction-modification system）;二、限制性内切酶分类：依据酶的组成、所需辅助因子及裂解方式分为三类;限制性核酸内切酶;酶识别序列结构呈二元旋转对称又叫作回文结构(palindrome)，即两条链的序列相同、方向相反（反向平行）;【经典举例】Eco RI;限制性核酸内切酶;（3）平头钝性末端：如Hpa I;工具酶 ;第二节 DNA克隆的基本过程;cDNA文库(cDNA library)：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库 。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。;一、化学合成法;目的基因的获得;目的基因的获得; PCR技术的发明;PCR操作应注意的问题：; 2、常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA ;重组体构建;DNA片段A ;二、平端连接;重组体构建; 2、转染（transfection）：将外源DNA导入真核细胞的过程 ;两个技术：制备感受态细胞和导入方法。;感受态细胞制备：;导入受体细胞的方法： 转化、转染、感染（转导）;五、“筛”：筛选出含重组DNA的受体细胞 ; 针对载体携有某些标志基因或目的基因的筛选方法，直接测定基因及表型。;Screening for desired recombinant by antibiotic resistance genes (clones 2, 5, and 8) ;【实例】质粒载体含?-半乳糖苷酶N端序列（LacZ基因），而突变株细菌中可表达?-半乳糖苷酶C端序列，只有在两者共同表达时，才有酶的活性。; pUC18质粒的多克隆位点整合在lacZ基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，lacZ基因便可表达出?半乳糖苷酶，??果平板培养基中含有IPTG（乳糖操纵子的诱导物）和X-gal，X-gal（ ?半乳糖苷酶的底物）便会被?半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。 在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了lacZ基因的结构，大肠杆菌形成白色克隆;重组子的筛选; 3、分子杂交法：用32p标记的探针与转移至硝酸纤维素膜上的重组DNA片段进行杂交，直接鉴定目的基因。 4、PCR/DNA序列测定;六、“表达”：使克隆基因在宿主细胞中复制、表达 ;基因工程的基本步骤;基因工程的基本步骤;第三节 重组DNA技术与分子医学的关系 ;基因工程产品;A tobacco plant in which the gene for firefly luciferase is expressed. Light was produced after the plant was watered with a solution containing luciferin, the substrate for this lightproducing enzyme (see Box 13-3, Fig. 2). Dont expect glow-in-the-dark ornamental plants at your local nursery anytime soon; the light is actually quite weak and this photograph represents a 24 hour exposure. The real point-that this technology allows the introduction of new traits into plants-is nevertheless elegantly made. ;基因工程的应用; 三、基因诊断; 1、基因治疗的方法 （分类）; 2、基本程序 ;Ashanti de Silva,