反转录病毒载体介导EGFP基因在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞的表达.docVIP

阿反转录病毒载体介导EGFP基因在SK-N-SH神经 母细胞瘤细胞的表达1 刘朝晖，许杰华，冯改丰，胡海涛 西安交通大学医学院人体解剖与组织胚胎学系，陕西西安 (710061) E-mail：huht@ 摘 要：目的 构建携带报告基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的反转录病毒载体并且探 讨病毒载体对SK-N-SH神经母细胞瘤细胞株的感染效率。方法 使用基因重组技术构建携 带EGFP基因的反转录病毒载体(RV/EGFP)。将稀释的RV病毒液感染NIH3T3 细胞，计数 NIH3T3 荧光表达细胞的数量来确定病毒的浓度。使用RV载体感染SK-N-SH细胞，通过流 式细胞学荧光检测明确RV在SK-N-SH细胞的感染效率。 结果 成功构建了基因转移载体 RV/EGFP, 确定重组病毒的浓度为 8.3×106 病毒颗粒 /mL。在SK-N-SH细胞RV/ EGFP稳定 转染并有效表达。在SK-N-SH细胞EGFP的荧光表达显示RV的转移并且表达的效率达到 30%以上。 结论 SK-N-SH细胞能被RV病毒载体有效感染，在转基因细胞株外源基因的 表达长期稳定并且显示RV病毒载体具有良好的基因转移效率。 关键词：SK-N-SH 神经母细胞瘤细胞，增强型绿色荧光蛋白，反转录病毒载体 体外细胞学实验是疾病的发病和治疗研究中一个重要的手段。它可以根据需要有效地 控制实验条件，能在短期内获得大量条件相同、性状相似且相对均一的实验样本。因此不 断在医学各研究领域广泛应用，在实践中取得了大量有意义的实验资料。SK-N-SH神经母 细胞瘤细胞株属于神经系统来源的肿瘤细胞系[1]，它的可传代性克服了神经元这种分化终 末细胞在体外无法分裂增殖传代，生长时间短的缺点。而且SK-N-SH细胞在细胞形态、生 理和生化功能方面与原代培养的神经元更为相似[2]，因此逐渐在神经系统疾病的研究中被 广泛应用。在我们利用RV载体构建疾病细胞模型研究中的研究中，通过观察及检测构建的 EGFP-RV病毒载体对SK-N-SH细胞株的感染及表达的效率，为下一步的实验提供重要的实 验数据。 1 材料与方法 1.1 试剂 pLXSN 质粒购自美国 Clontech 公司；pBV220/EGFP 由华广生物技术公司提供； 脂质体 2000 购自 Invetrogen 公司；EcoRI、BamHI 核酸内切酶、T4DNA 连接酶、G418、 Polybrene 购自 Sigma 公司； DMEM 培养基、胎牛血清购自 GIBCO 公司。 1.2 细胞株 SK-N-SH 神经母细胞瘤细胞株购自中科院上海细胞库；HEK293 反转录病毒 包装细胞系、NIH3T3 细胞由华广生物技术公司提供。 1.3 构建 pLXSN/APP695.sw 重组质粒 扩增 pBV220/EGFP 质粒，使用 EcoRI 和 BamHI 双酶切；将 pLXSN 载体质粒使用 EcoRI 和 BamHI 双酶切，分别回收目的基因片段 EGFP 和线性化载体 pLXSN。将回收的目的片段和载体使用 T4DNA 连接酶进行连接，16℃，16h。 连接产物转感受态细菌，挑取 X-gal 固体平板上的白色单个转化菌落扩增。小量提取质粒 并使用 EcoRI 和 BamH I 双酶切鉴定，质粒测序正确后进行扩增和大量制备。 1.4 表达EGFP的重组病毒的包装 复苏HEK293 反转录病毒包装细胞系[3],分组加入 不同浓度筛选抗生素G418 的选择培养基，两周后，确定G418 筛选剂量（为 400mg/L）。将 1本课题得到国家自然科学基金项目、教育部高等学校博士学科点专项科研基金项 目（20030698011）和陕西省自然科学基金项目（2001SM57）的资助。 -1- HEK293 传代，80％成片时使用脂质体进行pLXSN/EGFP质粒转染，转染 6-8h当细胞的立 体感和界限模糊时终止转染，换用完全培养基培养，待细胞状态恢复后，换用 400mg/L的 G418 选择培养基。两周后未转化细胞已经全部死亡，转化细胞已经生长出细胞克隆。分别 挑选出生长旺盛的 10 个克隆小心移植到 24 孔培养板中， G418 继续生长筛查，当细胞生 长成片到 100％后，收集上清滴定病毒，产生高滴度病毒的细胞克隆进行扩大培养。 1.5 计算病毒滴度 在 20mL的完全培养基中加入 10mg/L的 Polybrene，使用该液体系列 稀释被滴定的病毒原液，从 10 －1-10－8系列稀释。用稀释后的病毒液转染 80％成片的NIH3T3 细胞，转染 48h后用荧光显微镜观察荧光，寻找有荧光的细胞克隆小于 10 个的稀释浓度， 计算病毒滴度。病毒滴度使用cfu/mL表示。集落形成单位（c