用微通道分析仪(MC-FAN)进行的血液凝结活化和微血栓形.docVIP

用微通道分析仪（MC-FAN）进行的血液凝结活化和微血栓形成的实验室评价 摘要：迄今为止，全血中微血栓形成的实验室化验体系还未建立。微通道法可以通过血液流 动速率来评价在全血中微血栓的形成。在本研究中，我们以微通道分析仪（MC-FAN）作为 实验室化验体系，描述了血液凝结物活化和毛细血管堵塞的关系。经脂多糖（LPS）处理过 的全血流速对剂量和时间有依赖性并成下降关系。如果向全血中添加经 LPS 预处理过的单 核细胞（PBMC），血流速度将减慢。如果经抗组织因子（TF）预处理，抗体将阻碍由脂多 糖诱导而造成的血液流速下降，这暗示着表现在PBMC 上的TF 是造成微通道内血液流动速 度减慢的原因。一直的抗凝剂和抗血小板剂都会抑制由LPS 造成全血流速变慢。血栓-抗血 栓联合体在LPS-模拟全血中增加。如果在其中添加抗凝剂，血栓-抗血栓联合体减少，但对 抗血小板因子没有相关变化。这些发现表明在微通道内的堵塞主要是因为由纤维蛋白网和血 小板凝聚组成的微血栓。而这些微血栓是由于TF 在活性PBMC 上的表现而形成的。另外， 我们同样发现MC-FAN 对于毛细血管中的抗微血栓的实验室评价是非常有效的。 简介：炎症是免疫系统对于由诸如细菌和病毒引起的微生物病原体感染而造成的细胞和组织 损伤的反应[1]。凝结的通道可以通过这些微生物病原体进行活化，诱导在单核细胞上的组 织因子的表达[2]。TF 可以活化一系列的蛋白水解级联[3]，这致使凝血剂装转换为血栓。而 血栓又由纤维蛋白原中生成纤维蛋白。凝结的活化会促使凝结生成并降低纤维蛋白的消解， 这就导致在微血管中纤维蛋白凝结物的沉积，进而可能造成组织血液不充分灌注并造成多组 织缺障（MOF）[4]。 剧烈炎症会首先诱导位于单核细胞上的 TF 表达，激活血液凝结。TF 在主体对病菌感 染的响应上起了很大的作用[5]。我们知道，微生物诱导细胞活性性是凝结系统的TF 媒介活 性化的结果[6，7]。因此控制炎症响应将首要关联到增强血液的凝集性上[8-10]，而该病症 的多种关联病理反应是形成异常血管内凝结和最终会导致器官缺障的血栓的首要原因[11， 14]。因此测量微血栓的形成可以为器官紊乱程度提供信息，并为我们找出治疗的方法。但 是，目前还不清楚，微血管内如何产生堵塞和血栓如何导致 MOF。另外，一般的血浆凝结 测试可以包括活化部分凝血酶时间测定（APTT）、血浆凝血酶原时间测定（PT）、血小板凝 集测定，这些测试可以不能得到器官内的微循环状况和其后的外源性脂多糖（LPS）或 TF 诱导血凝结活性。 在本研究中，我们开发了一种新的临床化验系统，这就是通过微通道分析仪（MC-FAN） 来评价单核细胞活性对微血栓形成的影响。我们同样还利用 MC-FAN 检测了多种抗血栓剂 在毛细血管堵塞上的效果，并且发现该系统对于评价抗血栓和抗血小板剂在血栓紊乱上的效 果是非常有效的。 试验过程 材料 LPS（血清型 O26：B6）和 RPMI1640 培养基来自 Sigma（St. Louis,MO,USA）。单聚分解 培养基来自于Dainippon Pharmaceutical（Suita，Osaka，Japan）。胎牛血清（FBS）购自Gibco BRL，生命技术（Rockyville，MD，USA）。单克隆TF 抗体由Chugai 制药提供（Gotenba， Shizuoka，Japan）。Heparin 购自 Wako(Chuo-ku,Osaka,Japan)。Hirudin 来自日本能源有限公 司（Toda，Saitama，Japan）。Vlla 因子，活性蛋白C（APC）和TF 途径抑制物（TFPI）由 Chemo-Sera 协会提供（Okubo，Kumamoto，Japan）。TNFа和细胞重组可溶TM（sTM）由 Asahi Chem（Fuji，Shizuoka，Japan）提供。抗血小板GPⅡb/Ⅲa 拮抗剂（FK633）来自 Fujisawa 药业（Chuo-ku，Osaka，Japan）。针对抗血栓化合物（TAT）和凝血素片段 1+2（F1+2）的 酶标记免疫附测定法（ELISA）套件 来自Cedarlane（Hornby，Ontario，Canada）。 使用MC-FAN 测量血液流速的方法 图1A 示意说明了Kikuchi 利用MC-FAN 的微通道法[12]原理。MC-FAN 通过测定流过硅晶 片上的微小液体通道的血流来分析微血栓的形成。而这些微小液体通道是通过半导体精细加 工技术加工出来的（日立高科电子，东京，日本）。图 1B 说明了晶片固定器的设置，其中 包括一块刻蚀着8736 条7μm 宽（和微通道尺寸相近）、30μm 长的沟槽。刻蚀在单晶硅芯 片上的沟槽不会活化血细胞和血浆蛋白，在其上