神经生物学常用形态学研究方法讲解.pptxVIP

神 经 生 物 学 常 用 形 态 学 研 究 方 法 ;组织材料的处理;一、一般染色方法;焦油紫（cresyl violet）硫堇（thionine）甲苯胺蓝 (toluidine blue); 石蜡切片或冰冻切片 0.1%焦油紫染液37℃5-10min 烝馏水洗 70%Alc 3min 95%Alc 3min 100%Alc 1min×3次 二甲苯5min ×2次 封片。结果:尼氏小体紫色，本底无色。;DLG; Thionine staining;高尔基技术(Golgi technique);Cerebellum cortex neuron;利用轴浆运输现象追踪神经元之间联系的一种方法。 示踪剂：HRP（horse radish peroxidase，辣根过氧化物酶），快蓝（fast blue），荧光金（fluorogold），核黄（nuclear yellow），神经生物素（neurobiotin），生物素化葡聚糖胺（biotinylated dextran amine,BDA）;1，HRP的引入：压力注射法，电泳法，缓释法 2，Survial time：（束路长度 毫米/350毫米）+1日 3，Fixation and Section 4，Incubation Procedure: a,wash sections briefly in three changes of PB b,move the sections to the incubating medium (0.2%DAB,1%H2O2) kept at room temperature for 30-40min. c,wash three times in PB for stop the reaction. d,mounting and observation.;*;HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat;HRP labelling neurons in dLGN;Double-labelling of HRP and Glutamate in rat lateral geniculate nucleus ;荧光染料示踪法; Fast blue labelling neurons;Fast Blue Ladelling Ganglion Cells of Retina ;NO(nitric oxide)的生物合成： 催化NO生物合成的酶称一氧化氮合酶（NO synthase, NOS), NOS以L-精氨酸（L-arg)和分子氧为底物，消耗1.5mol NADPH和2mol分子氧生成NO和L-瓜氨酸。 NADPH:nicotinamide adenin dinucleotide phosphate Diaphorase:黄递酶 在神经系统大部分区域NADPH-d组织化学染色和NOS免疫组织化学染色一致。;Nos活性：a.协同因子有Ca2+、CaM、NADPH阻断任何一个协同因子结合位点都可抑制Nos b.底物:L-Arg NADPH-d活性:a:不需CaM、Ca2+作为协同因子，只需NADPH b；底物：NBT(亚硝基四唑氮蓝）;NOS活性≠NADPH-d活性,使用NOS抑制剂后不能用NADPH-d组化染色来分析NOS活性。 NADPH-d组化染色阳性细胞中可含有NOS,但不能说明有NOS 活性，NADPH-d组化染色阴性细胞中一般不含NOS.;a:冰冻切片b:0.05M Tris缓冲液漂洗c:于含0.2%Tritonox-100的Tris缓冲液中室温下预孵育5~10min.d:在含0.3%Tritonx-100,1mg/ml–NADPH,0.5mg/mlNBT的Tris缓冲液中37℃孵育1~1.5小时. e:Tris缓冲液漂洗，中止反应。;NADPH-d Staining In Caudate Nucleus;NADPH-d staining ;NADPH-d staining;利用特异性抗体对神经组织中某种特异成份(抗原)进行抗原--抗体反应,达到检测组织细胞内是否有此特异性物质.其本质就是用标记的抗体追踪抗原(以确定组织细胞内的某种化学物质).;*;应 用 与 评 价;1.Tissuue preparation:perfusion,section 2.Blocking:封闭，异种蛋白质间会有非特异性结合，常用正常羊血清（NGS）或牛血清白蛋白（BSA）封闭。 3