间充质干细胞联合明胶微冰胶材料对皮肤损伤治疗的可行性-研究.pdf

100ml溶液 0．59茜素红粉末 40ml溶液 0．29茜素红粉末 1)1％或O．5％茜素，成分如上表 2)氨水调节PH值到7．3，40ml溶液加lO山氨水； 3)取待染色细胞，弃去培养基，D．Hank’S轻轻洗2遍； 4)加入试剂盒内的1号液数滴，室温固定1分钟，自来水轻轻冲洗，甩干； 5)将配好的工作液滴加到细胞上，置湿盒内，37℃孵育30分钟／室温2小时； 6)流水冲洗2分钟，显微镜下观察并拍照； 注意：茜素红染色不要超过30分钟，否则背景深。 9．脂肪细胞油红。染色 保存； 2)油红O工作液的配制(配好后2小时内使用)：油红O母液：蒸馏水=3：2混 匀，室温放置30分钟，过滤后使用； 3)弃去培养基，用D．Hank’S洗2遍； 4)l号固定液固定1分钟，D—Hank’S轻轻洗2遍，将水分甩干； 5)加入油红O工作液染色30分钟～2小时 6)蒸馏水洗3次，显微镜下观察并拍照。； 10． Realtime PCR检测ADSCs干性基因的动态变化以及成脂成骨分化相关基因 表1引物序列 Tablel Primer sequences 万方数据 Runx2F：TGTCATGGCGGGTAACGAT R：AAGACGGTTATGGTCAAGGTGAA oPN F：ACTCGAACGACTCTGATGATGT R：GTCAGGTCTGCGAAACTTCTTA F：GGCGCTACCTGTATCAATGG R：GTGGTCAGCCAACTCGTCA GAPDHF：GGTCACCAGGGCTGCTTTTA R：GAGGGATCTCGCTCCTGGA 移至无RNA酶的1．5ml Eppendorf(EP)管中； 4℃，120009离心15分钟，； 3)分离RNA：离心后，混合液分成三层，下层酚一氯仿相，中间白色为蛋白， 上层无色水相，RNA在水相，将上层水相转移到新的EP管，注意勿吸到 lal； 白膜层，使RNA体积达400～500 4℃，120009离心10分钟； 心5分钟，洗2遍，切记不可将沉淀弹散，75％乙醇用无水乙醇和DEPC混 合配制； 6)干燥RNA：自然风干或无菌超净台吹5．10分钟，注意不要过分干燥，否则 会降低RNA的溶解度； 金属浴中放置5分钟，以增加溶解度； 8)取1¨l溶解后的RNA溶液用紫外分光光度仪检测RNA的纯度及含量，余 下的RNA溶液可置于．80。C保存，避免反复冻融。 (2)cDNA的合成：具体操作按照M—MLV反转录试剂盒说明书进行，两步法逆转 录： 1)在O．2ml无菌无酶Ep管中加入以下试剂： 50099／mlOligo(dT)1 8(普通基因)4pl 总RNA 299 8 万方数据 DEPCH20 补至20ul 2)涡旋振荡后，稍加离心，70。C，10分钟，4。C，9分钟： 3)在上述EP管中直接加入下列成分： 5xM．MLV逆转录酶缓冲液(含DTT)81al 10mmol／LdNTP 2p．1 DEPCH20 39l Rnasin