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十种中草药提取物用作新型多功能天然植物饲料添加剂初析 　　摘 要 目的：研制新型多功能天然植物饲料添加剂。方法：选取10种中草药，获得乙醇提取物后进行饲料防霉，抗氧化和减轻黄曲霉毒素损伤的活性检测，最后综合实验结果，确定在三方面相对功能佳的中草药。结果：公丁香（Syzygium aromaticum）在这三方面的效果最佳，其抑制饲料发霉菌的最小抑菌浓度（MIC值）为20 mg/mL，抑菌率为60%。公丁香的综合抗氧化能力得分最高为7.77分。公丁香提取物（30 μg/mL）预处理人肝细胞HL-7702细胞后显著减轻了黄曲霉素AFB1（21μg/mL）对细胞的损伤（P0.01）。因此，公丁香在开发新型多功能绿色植物饲料添加剂方面有着较好的前景。 　　关键词 中草药提取物；饲料；防霉；抗氧化；黄曲霉素；公丁香 　　中图分类号：S816.7 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2015）09-001-03 　　饲料的安全性能是食品安全的重要组成部分，保障饲料安全既是构筑坚实食物安全链的重要一步，也是我们落实十八大和“两会”精神，切实保障食品安全和人民健康的一个有力的落脚点。本文立足于天然植物饲料添加剂，针对当前广泛使用的传统的合成药物、抗生素等药用添加剂存在的安全性低、残留高、产生耐药性等问题的现状，对选取的公丁香等10种中草药提取物的抗霉菌、抗氧化和减轻黄曲霉素对人肝细胞损伤的活性做了系统的研究，旨在为新型多功能天然植物饲料添加剂的开发提供启示。 　　1 材料与方法 　　1.1 仪器 　　电热恒温水浴锅（DK-524；上海精宏），旋转蒸发仪（RE-52AA；上海亚荣），生化培养箱（SHP-150型），二氧化碳培养箱（MCO-20AIC），酶标仪（BIO-RAD680），恒温培养箱，可见分光光度计（722S），卧式落地培养摇床（TS-21113）。 　　1.2 试剂 　　小猪饲料（玉米-豆粕型）购于九鼎集团，货号my0158。人正常肝细胞系HL-7702。DPPH、DMSO、维生素C、硫酸亚铁晶体、水杨酸、邻苯三酚、山梨酸钾、高盐察氏培养基、MH肉汤培养基、RPMI-1640培养基、血清、胰酶和青链霉素。 　　1.3 方法 　　1.3.1中草药醇提物和饲料发霉菌的获得 　　将选取的10种中草药粉碎成粉末，各称取200 g，用无水乙醇浸没，80 ℃冷凝回流三次得醇提物，滤液用旋转蒸发仪45 ℃，0.095 MPa抽提得到浸膏[1]。参考董妍玲[2]等的方法获得饲料发霉菌：小猪饲料自然发霉（湿度75%、温度28 ℃）9 d后，分离纯化发霉菌。 　　1.3.2 防霉活性检测 　　1.3.2.1 纸片扩散法测抑菌圈 　　参考文献[3]、[4]的方法：DMSO滤纸片做空白对照，0.3 g/mL山梨酸钾做阳性对照，10种中草药提取物0.3 g/mL用量10μL，霉菌培养箱28 ℃培养3 d，测量抑菌圈直径。 　　1.3.2.2 中草药最小抑菌浓度MIC值的测定 　　参考文献[5]、[6]的方法：采用MH肉汤培养，96孔中1孔为空白对照组：200 μL MH肉汤培养基；2孔为正常生长对照组：150 μL 106 cell/mL菌液和50 μL MH肉汤培养基；3孔为150μL 106 cell/mL菌液和50 mL DMSO；其他孔为样品组：150 μL 106 cell/mL菌液和50 μL不同浓度的样品溶液。28 ℃培养箱培养20 h后，进行涂布。 　　1.3.2.3 饲料防霉效果评价 　　小猪饲料预混中草药提取物，自然发霉16 d后检测霉菌数量（方法按GBl3092-91《饲料中霉菌检测方法》），计算提取物抑菌率：提取物的抑菌率（%） =（对照样品的霉菌含量-试验样品的霉菌含量）/对照样品的霉菌含量×100%。 　　1.3.3 抗氧化活性检测 　　将10种中草药提取物分别进行DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除能力的测定，方法分别按参考文献[7]、[8]和[9]的方法进行，再综合3方面结果，参考陈永钧等[9]的方法做抗氧化能力综合评价。 　　1.3.4 霉菌毒素（AFB1）减毒实验 　　HL-7702细胞常规培养，设计如下。（1）对照组：加入含1%DMSO的1640培养液；（2）AFB1组（求AFB1的IC50值）：分别加入含60、50、40、30、20、10、5 μg/mLAFB1的1640培养液，每一浓度设3个复孔，48小时后，MTT检测细胞存活率[10]。（3）AFB1+中草药组：加入不同浓度的中草药提取物，每一浓度设3个复孔，48 h后加入AFB1的IC50浓度，再48 h后MTT法检测，计算细胞存活率。 　　2 结果与分析 　　3.1 中草药醇提物和饲料发霉菌