总糖和还原糖测定.pptVIP

实验一、总糖和还原糖的测定 ——3,5-二硝基水杨酸法 一、实验目的 1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理； 2、学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。 二、实验原理 还原糖是指含有自由醛基或者酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖；利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来；对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。 NaOH 黄色 棕红色 加热 在过量的NaOH碱性溶液中， 3-氨基-5-硝基水杨酸呈橘红色，在540nm处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值成线性关系。利用比色法，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。 三、实验器材 1、材料：山芋粉 2、仪器：电子分析天平、水浴锅、V-1100可见分光光度计、移液器 3、其他：试管、容量瓶、三角烧瓶、量筒、吸管（移液管）、洗耳球、玻棒、洗瓶、漏斗、离心管、六凹反应盘、pH试纸（1～14） 四、实验试剂 1、标准葡萄糖溶液（1.0mg/ml） 2、DNS试剂 3、6mol/L HCl 4、6mol/L NaOH 5、I2-KI溶液 五、操作 1、样品中还原糖的提取 准确称取0.5g山芋粉置于100ml三角烧瓶中 加3ml蒸馏水，调成糊状 再加30ml蒸馏水 50℃水浴，30min (不时搅拌) 转移至50ml离心管中，4000rpm，5min 上清液1 沉淀 加20ml蒸馏水，洗涤沉淀，4000rpm，5min 上清液2 沉淀(弃) 置于容量瓶中，蒸馏水定容至100ml,混匀，取1ml即可进行还原糖的测定。 2、样品中总糖的水解、提取 准确称取0.2g山芋粉置于100ml三角烧瓶中 加3ml蒸馏水，调成糊状 再加12ml蒸馏水，5ml 6mol/L HCl 沸水浴，30min (不时搅拌) 取1～2滴于六凹反应盘中，加1滴I2-KI溶液，如果完全不显蓝色，即可进行下面的操作。 冷却至室温 用6mol/L NaOH调pH7.0（ pH试纸） 蒸馏水定容至100ml,混匀 滤纸过滤，取10ml滤液用蒸馏水定容至100ml，成稀释1000倍的总糖水解液，混匀,取1ml总糖水解液，测定其还原糖的含量 3、制作葡萄糖标准曲线及还原糖、总糖含量的测定。 取8支洁净的试管，分别用记号笔标上0～7号，按照下表进行操作。其中0～5管，用于标准曲线的制作,以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/ml）为横坐标作图得标准曲线（用Excel表制作）。 管号 试剂 0 1 2 3 4 5 6 7 标准葡萄糖溶液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 1.0 蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 DNS试剂/ml 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温 蒸馏水/ml 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 葡萄糖含量/mg 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 C1 C2 A540nm a b 六、计算 C1V1 ω(还原糖)=——×100% m1 C2V2 ω(总糖)=——×0.9×100% m2 附：相关仪器使用 1、移液管的使用 2、移液器的使用 3、离心机的使用 注意配平，对称放 4、V-1100可见分光光度计的使用 比色皿 V-1100可见分光光度计 开机预热30min 测吸光度 选择波长（540nm） MODE键切换到T，将黑体放入光路中 合上盖，0键校零 MODE键切换到A，参比液放入到光路中 合上盖，100键调零 将待测液依次放入到光路中，即可得出待测液的吸光度。 比色皿的使用