新型丙型肝炎病毒亚基因复制子与稳定细胞系的构建.pdf

中 文 摘 要 很大的现实意义，为特异性靶向性抗病毒治疗（Specifically Targeted [6] Antiviral Therapy for Hepatitis C Virus ） 提供了高效的实验工具和手段， 能够加速治愈慢性HCV 感染药物的研发历程，从而有希望完全清除HCV 感染。 目的：利用 1b 型 HCV 亚基因复制子 pUC19-HCVreplicon 和 pBlueScript ⅡSK(-)、pGL4.79 质粒，利用22nt 小IRES 可以串联表达多个 结构基因的原理，构建同时表达海肾荧光素酶（Human Renilla Luciferase, hRluc ）和新霉素磷酸转移酶(Neomycin Phosphotransferase, Neo) 的新型 HCV 亚基因复制子pHCV-rep-hRluc 。通过在Huh-7 细胞中稳定表达，构 建一个新型HCV 亚基因复制子细胞模型，并经过系列研究，观察其作为 高流量药物筛选模型的特性。 方法：通过观察不同类型IRES 启动的绿色荧光蛋白的表达水平鉴定 22nt 小IRES 的表达效率及2 个小IRES 串联表达的可行性和实用性。利 用分子生物学实验技术，在表达筛选标记新霉素磷酸转移酶的HCV 亚基 因复制子pUC19-HCVreplicon 质粒的基础上，通过2 个小的IRES 表达报 告基因海肾荧光素酶和HCV 非结构基因区构建新型HCV 亚基因复制子 ——pHCV-rep-hRluc 。经体外转录，获得HCV 复制子RNA ，转染Huh-7 细胞后，G418 加压持续筛选，形成稳定表达新霉素磷酸转移酶和海肾荧 光素酶的新型 HCV 亚基因复制子细胞系。倒置显微镜对比 pUC19-HCVreplicon 和 pHCV-rep-hRluc 细胞系的克隆形成率（Cloning Efficiency ）情况，通过荧光定量RT-PCR 检测新型复制子细胞系中HCV RNA 的表达并对比HCV RNA 表达水平和hRluc 表达水平，通过Renilla Luciferase Assay 实验测试不同浓度干扰素α2b （Interferon-α2b,IFN-α2b ）、 利巴韦林（Riboviron,RBV ）和 HMG-CoA 还原酶抑制剂(HMG-CoA reducase inhibitors)对复制子 RNA 的抑制作用。并通过 RT-PCR 检测 IFN-α2b 处理24 小时后MxA 基因的表达水平，观察干扰素信号转导通路 在稳定复制细胞系中的表达情况。 结果：倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达，发现单一22nt 小IRES 的表达效率明显高于EMCV IRES ，两个小IRES 串联表达的效率与EMCV IRES 相似或稍微减弱，仍可见明亮的GFP 表达，证实了这一策略是可行 的。成功构建了新型亚基因复制子质粒pHCV-rep-hRluc 。体外转录的HCV 3 中 文 摘 要 RNA 转染Huh7 细胞后，经G418 筛选，获得了HCV 复制子稳定复制的 细胞株。新型亚基因复制子pHCV-rep-hRluc 较pUC19-HCVreplicon 的克 隆形成率高出约2 倍水平。新型HCV 亚基因复制子细胞克隆胞浆内HCV RNA 的表达水平和 hRluc 的表达水平的高低一致，一定程度上说明了 hRluc 可代表HCV RNA 复制水平。RBV 对稳定表达hRluc 的细胞系HCV RNA 的表达具有明显抑制作用，IFN-α2b 对其抑制作用不明显，但在瞬时 转染实验体系中，IFN-α2b 和RBV 均能够有效抑制HCV RNA 的表达。 HMG-CoA 还原酶抑制剂辛