GGE技术及其在微生物研究中的应用.docVIP

变性梯度凝胶电泳 -DGGE 变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术具奋精确、快速、易操作等特点， 能克服传统微生物研究方法的不足，作为一种分析微生物群落的奋效工具被广泛 的应用于现代微生物研究。木文介绍了 DGGE技术的原理、操作步骤及应用情况, 并讨论了其缺点及应用前景。 关键词:DGGE 关键词: DGGE分子生物学微生物群落菌群分析 1引言 变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技术是 由Fischer和Lennan111于1979年首先提出了，并将其用于民学上基因点突变的检 测。与传统的琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，这项技术可以分辨只 有一个碱基差异的基因序列。1985年,MyersRM[2]等人首次在DGGE+使用“GC 夹板”和异源双链技术，使该技术H臻完善。1993年，Muyzers131等人首先将PCR 技术与DGGE结合，在微生物生态学领域首次采用PCR-DGGE方法分析检验 r*RNA的基因，证实了该技术在揭示然界微生物区系的遗传多样性和菌群差异 方而具有独特的优越性。此后的十几年|A)DGGE技术在研究微生物多样性和种群 差异上已成为一种重要工具，并被广泛用于活件污泥、池塘底泥、污染土壤、海 洋、冰川等环境样品以及食品、动物肠道屮的微生物多样性检测和种群演替的研 究。 2基本原理 PCR-DGGE技术主要是先利用特定的引物合成一定长度的rRNA的基因序 列，然后利用梯度变性胶来分离DNA片段。梯度变性胶是在一定的浓度聚丙烯 酰胺凝胶屮添加不同浓度的变性剂，使变性剂形成由低到高的线性梯度。电泳时, DNA在胶中的迁移速率仅与其分子大小有关，当DNA到达具有一定浓度变性剂 时，DNA双链开始解链，迁移速率开始降低。当DNA双链完全分开时，其电泳 速率急速K降。由于不同的DNA片段碱基组成存在差异，其变性条件也有所不 同，在凝胶上会停留在不同的位置，经染色后形成不同条带。理论认为，只要选 择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、温度等足够精细，有一个碱基差异的 DNA片段都可被分开，在不同泳道中停留在相同位置的条带，一般可视为其宥相 同的DNA序列。 为了使仅有一个碱基之差的不同分子取得最好的分离效果，须先选择所研 究的DNA范围及电泳过程中所需的变性剂浓度梯度。由于DNA解链温度的升高 时迁移速率的变化不明显，难以将野生型和突变型DNA分开，所以高温解链区 的突变往往难以检测［11］。而且，高温解链区的解链时间较松，也限制了DGGE的 使用。解决的办法是在DNA片段上连接一段长度为30?50bp富含GC的核苷酸序 列，该序列被称为GC夹板(GC-clamp)。在DGGE分析过程中形成一个人工高温 解链区，使DNA片段的其他部分处于相对的低温解链区，从而易于分析。 3技术步骤： 样品总DNA提取 样品16SrDNA片段的PCR扩增 DGGE条件优化与分析 割胶测序等盾续分析。 3.1样品总DNA提取 群落总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础，样品中细菌种类复杂H 混杂宥大量宥毒物质，如何使所宥细胞裂解、充分释放DNA、宥效去除杂质，建 立高效、可靠的DNA提取方法成为研究者关注的热点。当前主要使用超声波法、 基于SDS的裂解法、改进的化学裂解法、微波法、冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS 和DNA试剂盒法等6种DNA提取方法。 3.2样品16SrDNA片段的PCR扩增 PCR扩堉是PCR- DGGE技术中至关重要的步骤。PCR全过程包括三个基本步 骤：变性、退火、延伸。反复进行变性、复性和延伸的循环，从而使扩增DNA产 量呈指数上升，经25?30个循环后，扩增倍数可达106倍。 在多重PCR中很容易产生PCR偏差和PCR假阳性，这样就不能真实客观地 反映微生物群落的多样性，甚至显示实际上并不存在的微生物信息。卜而就简要 介绍一下常见的PCR偏差和PCR假阳性及其排除方法。 由引物与模板的退火温度引起的PCR偏差。在多重横板PCR中，引物不可能 与所宥的模板序列都完全互补，两考之间会宥一个或几个碱基的错配，大大降低 了这类模板的扩增效率，这样就会产生严重的PCR偏差。排除这种PCR偏差的方 法是适当降低退火温度或使用简并引物。在PCR最终产物中，不同序列浓度趋于 1B1,掩盖了模板起始浓度的差异。这是由于起始浓度低的模板经扩增石其PCR 产物又作为模板继续扩增，且在PCR的最肜几个循环其扩增效率高于PCR产物更 为丰富的其他序列，使最终产物浓度趋于1B1。排除这种PCR偏差的方法是减少 PCR循环数，提高从变性温度到退火温度的降温速率。异源DNA序列的产生。这 是由于随着PCR扩增循环数的增加，产物浓度逐渐增高，引物逐渐减少，异源 单链