GI58实验方案.docVIP

实验方案 1. CGI-58基因的克隆 1.1总RNA提取 川TRNzol-A7（天根生化科技奋限公司）提取乌金猪背最长肌的总RNA，RNA储存在-8CTC 冰箱巾待用。 1.2反转录 根裾所测RNA的浓度，取2 u g总RNA，川反转录试剂盒（北京全式金生物科技行限公司） 进行反转录，操作方法严格按照试剂盒说明书执行，。反转录后的cDNA于-2（TC保存。 1. 3 PCR 根裾GenBank上猪的CG1-58基因序列，登录号为AY902463. 1,用Primer 5软件设计 R的基因，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，鬥的片段1050bp。 引物： 上引：ATGGCAGCAGAGGAGGAGGA 一 下引：TCAGTCCACAGTGTCACAGA PCR反应体系为25y L:模板cDNA: 1 u L、上游引物和下游引物各1 y L （引物浓度为 IOmM） ,、Buffer:2.5uL、 dNTP:2yL、酶:0.25mL、水:17.25uL。 PCR反应条件：预变性94°C 3min变性 PCR反应条件： 预变性 94°C 3min 变性 94°C 30s 退火 68 °C 30s 延伸 72°Clmin 后延仲 72°C10min 1.4连接与转化 酶连体系（10 m 1 体系）： P.MD18-T Ip 1 DNA胶回收产物 4u 1 }35循环 ■ Solution I 5 n 1 （冰上融解） （PCR 仪中 16°C 90min） 1.5转化 把熏组质粒转化到人肠杆荫受体细胞中，其体步骤如卜： 1） 取50 ul稍混匀后的感受态细胞悬液（冰上解化冻30niin后进行下述操作）。 2） 加入上述10 ul重组质粒DNA连接溶液（含fi不超过50 ng），轻轻摇匀。 3） 42°C水浴热激45-90s （热激期间不要摇动离心管），后马上转移至冰上，放置1分钟。 4） 然后向管中加入37°C预热的940 u 1的LB液体培养?,混匀。 5） 37°C培养1小时，使细胞恢S正常生长状态。6000rpm离心4min,倒棹多于液体（剩 100-200u 1）。 6） 将菌液涂布于LB同体培养基上，37°C过夜培养12h。4°C放置3h以上。 1.6挑菌50ml管内加10ml LB液体培养基（加入10 pi Amp）,用白枪头挑菌，每个挑10 管。 1.7保种LT油0.8ml和0.8ml的菌液，送一管测序，其余-80度保存。 1.8质粒DNA的提取 1） .取过夜培养的2ml菌液，8000g离心2分钟，彻底去除上清。 2） .加入250tU Buffer Pl,川枪头或振荡器充分悬浮细蘭。 3） .加入250ul Buffer P1I,温和上卜颠倒或用手指弹管底，使细苘裂解，室温放置（2分 钟左右）至溶液变成澄清。 4） .加入350u 1 Buffer PIII,温和上下颠倒5—10次，使之充分中和，室温放置2分钟。 注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。 5） . 12000g,离心10分钟，上清液移入吸附柱。 6） .8000g离心30s,倒掉收集管液体,ill A 500 u 1 Buffer DW1, 9000g离心30s,倒掉收 集管液体。 7） .加入500ul Wash Solution, 9000g离心30s,倒掉收集管液体。 8） .重复步骤7—次。 9） .空吸附柱9000g离心1分钟。 10） .将吸附柱放入干净的1.5ml的离心管中,在膜中央加50-100U 1 Elution Solution, 室溢下放置1分钟，离心1分钟。 11） .洗脱的质粒可以立即用于各种分了?生物学操作或-2（rc保存备用。 1.9限制性内切酶消化（双酶切） EcoR I : 1m 1 Hindlll: 1 u 1 DdH20 :8 u 1 质粒 DNA: 8u 1 2. CGI-58基因表达载体的构建 2.1菌液活化试验 对CGI-58测序正确的保存菌液进行活化，将100 p L菌液接种于lOmlLB(含Amp)液体培 养基进行培养；37°C, 220rpm震荡培养12-14h。 2.2表达载体菌液活化试验 M1GO1B11B21631B41BS16B16CTAGCGCTACCGGACTCA6ATCTC6AGCTCAAGCTTCGAATTCTGCA6TC6ACGGTACCGCGGGCCCG6GATCC..IRESNhe[ fco47 IIIBffin Xho\Sac IfcoR I M1 GO1 B11 B21 631 B41 BS1 6B1 6CTAGCGCTACCGGACTCA6ATCTC6AGCTCAAGCTTCGAATTCTGCA6TC6ACGGTACCGCGGGCCCG6GATCC..IRES