MT1基因转染永生化内蒙古绒山羊皮肤成纤维细胞的-研究.pdfVIP

摘 要 褪黑激素 (Melatonin，Mel)通过与其高亲和性 G 蛋白偶联受体的结合来发挥调节 季节性繁殖、毛发生长周期调控等生物学功能。褪黑激素在毛发周期调控过程中的作 用机理研究的尚未清楚，为了研究褪黑激素在毛发周期调中基因调节功能，本研究利 用脂质体法将褪黑激素膜受体 1 基因（MT1）导入永生化绒山羊皮肤成纤维细胞中， 筛选得到稳定表达细胞株，为进一步研究褪黑激素调节毛发周期的基因调控模型和褪 黑激素的作用机理奠定了基础。 研究中将编码 hTERT 基因导入内蒙古绒山羊皮肤成纤维细胞，经过 G418 筛选得 到阳性克隆，经扩大培养后不断传代得到永生化细胞系。RT-PCR 检测目的基因在阳性 克隆中稳定表达，生长状态良好连续传代 60 代，并将其命名为永生化绒山羊皮肤成 纤维细胞系(hTERT-GSFs)。 表达载体 ppEGFP-N1/MT1 的构建，通过 RT-PCR 方法利用绒山羊下丘脑总 RNA 获 得 MT1 基因编码区 cDNA 序列，并将 MT1 片段连接在真核表达载体 pEGFP-N1 的 XholI+SalI 位点，构建表达载体 pEGFP-N1/MT1。分析表明本研究所构建的表达载体 pEGFP-N1/MT1 结构与序列均与预期设计相符合。 用脂质体法将 MT1 基因导入永生化绒山羊皮肤成纤维细胞，经倒置显微镜检测， 采用滤纸片消化法活得表达绿色荧光蛋白的转基因细胞，PCR 技术检测 MT1 的表达， 实验组表达 MT1，而对照组细胞不表达 MT1，表明构建的载体具有正常的功能。通过 对转基因细胞基因组 DNA 的PCR 扩增，证实外源基因已稳定整合在转基因细胞基因组 中，将表达 MT1 基因的阳性细胞命名为 MT-hGSFs，转MT1 基因的细胞成功获得为进一 步研究褪黑激素的作用奠定基础。 关键词:绒山羊；褪黑激素受体 1；基因转染；成纤维细胞； Study on MT1 gene transfected into immortalized Inner Mongolia cashmere goat skin fibroblast cells Abstract Melatonin is a critical regulator of neuroendocrine hormones as high affinity through its G protein-coupled receptor binding to perform their biological functions. Melatonin on the body in mammals has a very wide range of physiological regulation, including the regulation of seasonal breeding, hair growth cycle regulation, food intake, obesity, body temperature regulation, pigmentation, sleep, circadian rhythm, cell growth, immune response, etc. While the mechanism of regulation hair growth was unclear. To clarify melatonin in the cell function of gene regulation during development, this study liposome into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1/MT1 to immortalized goat skin fibroblast cells, stable cell lines were screened for further study of melatonin regulating hair c