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第4节分子生物学方法及其
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第6章第4节 分子生物学方法及其
在中医研究中的应用
一、名词解释(每题2分)
1.质粒
答案:质粒是一类双链、闭环的DNA分子,存在于细菌体中,独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是分子生物学技术中最常用的载体。
2.重组载体
答案:重组载体指采用适当的限制酶切割开载体,采用DNA连接酶将插入载体切口的目的DNA片段与载体DNA片段重新连接起来。
3.黏性末端
答案:黏性末端指DNA片段端含有几个突出的核苷酸单链末端,该单链核苷酸碱基与该DNA片段的另一端或其他DNA片段的突出的核苷酸单链碱基互补配对,称为黏性末端。
4.钝性末端
答案:钝性末端指一些限制性内切酶在二重对称轴上同时切割DNA的两条链,则产生带平端的DNA片段。
5.限制性核酸内切酶
答案:限制性核酸内切酶能特异性地结合于一段该酶能识别的双链DNA序列上,切割该双链DNA,切割结果可产生黏性末端或钝性末端。
6.DNA聚合酶
答案:DNA聚合酶是指能催化4种脱氧核苷酸合成DNA,催化脱氧核苷酸3’-OH与脱氧核苷酸5’-P之间形成磷酸二酯键反应的酶。真核细胞有5种DNA聚合酶,原核细胞有3种DNA聚合酶。DNA聚合酶I是单链多肽,可催化单链或双链DNA 的延长;DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关;DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多,是促进DNA链延长的主要酶。这些酶作用时大多需要模板,合成产物的序列与模板互补。
分子生物学实验最常用DNA聚合酶有PCR使用的Taq酶、大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)和大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)等,主要用于催化DNA 体外合成反应。
7.连接酶
答案:连接酶是指使各具有游离的5’-P和3’-OH的相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键,将两段DNA连接起来的酶。最常用的是T4噬菌体连接酶。
8.脱氧核糖核酸酶I
答案:脱氧核糖核酸酶I(DNA酶I)为内切核酸酶。它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA。产物为5′端带磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。在Mg2+存在下,DNA酶I可独立地存在于每条DNA链且切割位点随机分布。
9.反转录酶
答案:反转录酶是指能以RNA为模板催化合成互补DNA链的酶。
10.琼脂糖凝胶电泳
答案:琼脂糖凝胶电泳为采用琼脂糖凝胶的水平电泳。在分子生物学中常用以分离和鉴定DNA和RNA。琼脂糖凝胶电泳通常可分离200bp~50kb的DNA,在溴乙锭染色下,可清晰地辨别少至50ng的DNA,甚至10ngDNA也能辨别得出来。
11.聚丙烯酰胺凝胶电泳
答案:聚丙烯酰胺凝胶电泳为采用聚丙烯酰胺凝胶的电泳,多为垂直电泳。在分子生物学中常用以分离和鉴定DNA和蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳多用于分离5~500bp的DNA,精密到可以分离开仅差一个核苷酸的DNA,因此常用来测序。
12.RNA制备
答案:RNA制备指从组织细胞中分离和纯化RNA。RNA制备的方法有多种,比较常用的是酚/氯仿制备总RNA一步法。该方法采用强RNA酶抑制剂异硫氰酸胍,抑制RNA的降解,并使RNA与蛋白质分离进入溶液,离心后,RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相,之后被异丙醇所沉淀。该方法操作简便,一次可以分离大量的RNA。提取的RNA可用于Northern blot和过Oligo dT柱,后者用于分离mRNA。
13.Northern blot
答案:Northern blot 即RNA印迹杂交,是RNA分析的常用方法。该方法首先采用电泳将不同分子量的RNA分离;随即将RNA从凝胶中转移至硝酸纤维素膜上,固定;再用已知的DNA或RNA作探针,与硝酸纤维素膜上的RNA杂交,分析所检测RNA的分子量和含量。近似的还有RNA的斑点杂交和狭缝杂交。
14.Southern blot
答案:Southern blot 是DNA印迹杂交,是DNA分析的常用方法。该方法首先采用一种或多种限制酶消化DNA,琼脂糖凝胶电泳把分子量大小不等的DNA分开,运用虹吸或电印迹法将DNA转移至硝酸纤维素膜上,固定,使DNA牢固地结合在硝酸纤维素膜上,与放射性标记或非放射性标记的探针杂交,杂交后洗去未被结合的探针,进行放射自显影或X光片曝光,在胶片上出现被检测的DNA显影条带。也可以用冷CCD照相机直接对杂交膜进行拍照,分析被检测DNA杂交条带。
15.Western blot
答案:Western blot是蛋白印迹法,是常用的蛋白质定性和定量检测方法。该方法将待测蛋白样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中,经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后,将分子量大小分离的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上,然后将此膜与抗靶蛋白的非标记抗体一同温育,结合上的抗体再与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗
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