hURAT1基因5’UTR区荧光素酶表达重组体的构建　.doc

hURATl基因5’ UTR区焚光素酶表达重组体的构建 ：刘贤贤，李长贵，王瑶，吕森森刘贤贤 】目的构建人尿酸盐转运蛋白1 (hURATl)基因 5’ UTR区荧光素酶表达重组体。方法PCR扩增包含hURATl 基因启动子最小功能单位和5’ UTR区域在内的DNA的片段， 克隆至荧光素酶表达载体pGL3?basic,构建hURATl5，UTR 区表达重组体。重组体经双酶切后测序进行鉴定。结果克 隆获得的590bp的D NA序列与GenBa n k报道的一致，且插 入方向正确。结论成功构建了含hURATl基因5’ UTR区的 荧光素酶表达载体，可用于后续功能研宄。 关键词】人尿酸盐转运蛋白1;荧光素酶；高尿酸血 症 [A BSTRACT ] Obj ectiveToco n structthe lu ciferase exp ression reco mbinan tcont ainin ghuman urat etransp ort erlgene(hU RATl)in5’ u ntranslate dregion(5? U TR). Methods Thesmalles t functiona lu nitofhUR ATI genepro mote randDN Asegm entsi n5 UTR were amplifi edw iththehu ma ngenomeDN A byPCR,thes egmentwascl onedintothe luciferase e xpression ve ctorpGL3 ?ba sic.The reco mbinan twasd etect edbyen donu cleasea nds equenced . R esultsThe s equencedse gment(590bp ) obtainedin therecombi n antswasid en ticaltot hat reporte dbyG enBank andth esegm entedi nthe correct dir ection. C on clusionTh e luciferase expressionr ecombinantc ontainingh U RATlin5? U TR issucces sfu llycons true ted, wh ichca nbeus edfors ubse quentfu net ionresea rc h. ［KEYW ORDS］ humanu ratetranspo rtproteinl ； luciferas e； hyperuri cae mia 原发性高尿酸血症及痛风为一种常见病和多发病。研 究已经证实，90 %以上原发性高尿酸血症是因肾脏对尿酸的 排泄减少所致［1?2］,人近曲小管上皮细胞膜上多个转运蛋 白参与了肾脏对尿酸的排泄，其中人尿酸盐转运子l(h UR ATI)是维持血尿酸水平的关键离子通道，是原发性高尿酸 血症和痛风的重要候选基因［3?4］。hUR ATI基因位于llq 13 区，其含有1 0个外显子和9个内含子，cDNA全长为264 2bp,编码区长为16 59bp，编码555个氨基酸［5］。5’ UT R为连接第一外显子和启动子区的非编码序列，该区域在基 因转录和翻译过程中发挥重要的调控作用，其SNP可明显 影响启动子活性，影响基因表达。hU RATlmRNA主要在人肾 小管上皮细胞中特异性表达，临床上得到含有待研究SNP 位点肾脏标本的概率很小，所以体外重组体的成功构建成 为研究hURAT 1基因突变或SNP影响基因启动子活性及其表 达的主要手段。本文通过PCR技术扩增h URAT1基因启动子 最小功能单位和5’ UTR区域在内的DNA的片段，克隆到真 核表达载体 pGL3?ba sic 中，构建 pGL3 ?basic/hURA T15’ UTR重组体，为今后研宄该段区域基因变异对表达的影响奠 定基础。 1材料和方法 实验材料 主要实验材料包括：基因组DNA提取试剂盒(TAKARA)、 K 0 DDNA 聚合酶(TO YABO)、QIAqu ickGelExtra ctionKit (Q I AGEN)、pGE M?TEasyVec tor (PROMEG A)、T 4DNA 连接 酶(PRO MEGA)、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂、氨苄青霉 素(SANGON)、限制性内切酶(FER M ENTAS)、pGL 3?basicvect or (INVITROG EN)、DH5 a 感受态细胞(TIANGE N)、质粒小规模抽提试剂盒(AXYGEN )。仪器：PTC?2 25 型高通量PCR仪(MJR)、UVP凝胶成像