VES诱导口腔鳞癌Ta8113细胞凋亡的实验研究　.docVIP

VES诱导口腔鳞癌Tca8113细胞凋亡的实验研究 关键词】VES;，口腔鳞癌；，bax基因 】目的明确VES对口腔鳞癌细胞Tca8113的作 用，为临床应用VES防治口腔鳞癌提供科学的实验数据。 方法RTPCR法检测促凋亡基因bax在mRNA水平上的表达， Westernblot检测促凋亡基因bax在蛋白水平上的表达。结 果bax基因在mRNA水平上及蛋白水平上表达上调。结论 VES诱导口腔鳞癌细胞Tea 8113的凋亡作用，b ax基因可 能参与该过程。 关键词】VES; 口腔鳞癌；bax基因 [Abs tract ] 0 bje ctiveTop ro beintovit a minEsuccin ateforselec tiveantitum ouractivit y inoralsqu am ouscellc arc inomas. Meth odsUsi ngRTP CRdet ecteda ndqu antifie dth eexpress io nofbaxmRN A . Westernbl otmeasuredr elativeamou ntsoftheba x BaxmRNAan dp roteinle vel sThemec hani smofap optos isisp ossibl yrel atedtot hee xpressio no fbax. K eywords ] VES ，oralsquamo uscellcarc i nomas, bax ge ne 维生素E琥珀酸酯(vita minEs uccin ate, VE S)因其 含有0⑶(C H2)2C00基团，在生理酸碱条件下可以带电荷， 这个基团在高选择性地诱导肿瘤细胞凋亡的过程中扮演了 重要角色［1 ］，根据众多文献报道［2~4］, VES对前列腺 癌、乳腺癌、消化道系统的恶性肿瘤特别是对头颈部肿瘤 有明显的抑制作用，其主要作用机制是诱导肿瘤细胞或者 刚刚变异的细胞凋亡。本文采用体外培养的口腔鳞癌细胞 T c a8113株检测了 b ax基因在VES诱导的口腔鳞癌细胞凋 亡中的表达。 1材料和方法 1.1材料VES购自Si gma公司，T ca81 13细胞株购 自中科院上海细胞所，RPMI16 40培养基购自Gibe o公司， bax 基因引物：5 TGGCGATG A ACTGGACAAC AAC3，5 CCC GAAGTAGGAAA GGAGGC3z ； actin 基因引物 5 AA CCGTGAAA AGATGACCCAG3，5 CTCC TGCTT GCTGA TCCACA T3。 2方法 1. 2. 1细胞培养Tc a 8113细胞接种于细胞培养瓶中， 加入含10 %小牛血清，100U/ml青霉素、链霉素的R PMI1640培养液，培养于37°C、5 %⑶2培养箱中，每3~4d 传代1次。 1. 2. 2反转录聚合酶链式反应（RT PCR）：选取实验 组、对照组细胞，加入1 mlRNAexRea gent,将细胞并RN AexReagent 一起移入Ep管中。室温静置5min,再加入20 0 Ml氯仿，用力颠倒Ep管混匀。静置5min后，1200 Or/mi nlOmi n。小心将上层水相移至Ep管中，加入50 0 y 1异丙 醇，振荡混匀，室温静置8mi n。高速离心5min,小心弃 上清。力口入1ml 75%乙醇，振荡片刻，7500r/min5 m in，小 心弃上清。室温静置12min使RNA沉淀恰好干燥，加入水溶 解RNA。7 20分光光度计上测2 60nm、2 80nm的0D值，计 算RNA的浓度。取等量R NA、OligdT、D E PC水共13 y 1。 7 0°C加热8min,立即将微量离心管冰浴至少1 min,然后 加入下列试剂：5 buffe r5 ul, dNTPs 5 y 1，MMLVRT 1 u 1，Rasinl pl，轻轻混匀，放入37°C恒温水浴锅中6 Omin。 90 °C，2?3min。50 ul反应体系：灭菌三蒸水34 ul，引 物 llul，引物 21ul，10 7 buffer(MgC 12/L)5u 1, d N TPs5 u b Ta q 酶lul，cDNA 3 u 1 ,混匀，750 Or/m in30s,石蜡油覆盖。PCR循环参数设置：预变性9 4°C 350s,变性 9 4°C60s,退火 60 °C 60s，延伸 72 °C 60s，再延 伸72°C300s，共35个循环。 1. 2. 3We s ternBlot定量蛋白：收集实验组、对照组 细胞裂解，SD S聚丙烯酰胺凝胶加样，当溴酚蓝到达胶底 部时停止，把胶放入缓冲液中平衡10m in。转膜后放入5