WesternBlt实验实用技术手册.docVIP

Western Blot实验技术手册 Western Blot是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开，然后转移到固相 载体（杂交膜）上，然后通过抗原抗体反应检测杂交膜上的靶蛋白是否存在，从而检测到靶 蛋白在待检测样本中的表达情况。鬥前Western Blot己经是蛋白检测的最常用和成熟的技术 之一. 一、Western Blot基本操作流12图 细胞/组织蛋白提取 I蛋白定量、蛋白变性 上样、电泳 I 一转膜 封闭 孵育一抗 I洗膜 孵育二抗 I 冼膜 底物孵育 I 曝光或显色 二.Western Blot 操作步骤 蛋白提取、处理 蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据样本类型和检测类型选择合 适的蛋白制备方法是至关重要的。使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样 品. 对于贴壁培养的细胞，经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂， 然后吸浄PBS，加入预冷的裂解液，最后用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地 转移至预冷的微量离心管中，4°C离心12,000 rpm, 20 min （根椐细胞种类不同调整离心力）， 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀. 对于组织样品，用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量罝于冰上以防蛋白酶水解，将 组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，忪期 可保存于-80°C,每约5 mg加入约300 gl预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4°C摇 动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml，理 想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml）., 4°C离心12,000 rpm，20 min,轻轻吸取上清，转移至新预 冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀 提取蛋白后进行蛋白的定量，蛋白的快速定量方法主要蛋白本身的发色基团，或者与其 他显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量.目前常用的主要有直接紫外吸收法，Bradford法、 和Lorry法或BCA法，一般推荐用BCA法. BCA测定方法如下： A.酶标板操作 1. 准曲线的绘制：取一块酶标板，按照丁表加入试剂 孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 蛋白标准溶液（gL） 0 1 2 4 8 12 16 20 去离子水（pL） 20 19 18 16 12 8 4 0 对应蛋白含量（pg） o 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 2、 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B （50:1）配制适量BCA工 作液，充分混匀； 3、 各孔加入200（iLBCA工作液； 4、 把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37°C放置30分钟，然后在562mn下比色测定。以蛋 白含镒（pg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线； 5、 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20PL，加入BCA工作液200pL,充 分混匀，37°C放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562mn波长下比色，记录 吸光值； 6、 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即iij查得相应的蛋白含量（pg）,除以样品稀释 液总体积（20PL）,乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度（单位：gg/ul）。 三、样品处理 一般的抗体只能识别抗原蛋白屮的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结 合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，蛋白变性一般使用含PN离 子变性去污剂如SDS的上样buffer （loading buffer），并于95-100°C煮沸5分钟，对于 多次跨膜蛋白，可以于70°C加热5-10分钟，标准的上样buffer称力2X Laemmli buffer， 上样时与样本混合后变性上样即可，为了减少样品的稀释比例，也可制备4X或6X的上样 缓冲液，如果上样buffer称力2X Laemmli buffer,上祥时与样本1: 1混合后变性上样即可. SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带 负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS电泳可将不同分子量的蛋白分离开。 四、PAGE电泳分离蛋白和转膜、封闭 1）、电泳 聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE胶是由两种化合物聚 合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）.,聚合需加入过硫酸铵及DMAP 或TEMED，凝胶为屮性、水溶性、三维网状结构。凝胶的孔径取决于总W烯酰胺的百分含 量（%T））和交联度（％C） , T%=（a+b）/m*100%;和 C%=a/（a+b）*100%,其中:a=双体（bis） 的重