《核酸探针标记》课件.pptVIP

五、巢式PCR（nested PCR） 巢式PCR（nested PCR）是一种PCR改良模式，它使用巢式PCR引物来增强反应的敏感性和特异性，巢式PCR方法由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成，在第一轮扩增中，使用一对外引物产生扩增产物，然后用一对内引物对第一轮扩增产物进行第二轮扩增。以上方法适用于多种DNA及RNA病毒的检测，如HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA、CMV DNA 、HTLVⅠ／Ⅱ DNA、 HGV RNA等。 长PCR（Long range PCR） 27 kb fragments are possible from good quality genomic DNA, Taq DNA polymerase for high processivity (i.e. 5’-3’ polymerase activity) usually Pwo with 3’-5’ proofreading abilities This combination of features allows longer primer extension than can be achieved with Taq alone. ? 谢谢使用！ * 生物素标记探针的检测 过氧化物酶 ＋　底物（ＤＡＢ） 抗生物素蛋白 生物素 棕褐色不溶性的化合物 （三）膜固相杂交的类型 １、斑点及夹缝印迹杂交（dot blot and slot blot)：检测DNA或RNA（定性或半定量） ２、Southern 印迹杂交(Southern blot)：　　 检测DNA大小、存在状态 DNA电泳 变性 转膜 杂交 吸水纸 玻璃板 重物 滤纸 凝胶 盐桥 Southern转印 3|、 Northern印迹杂交(Northern blot)： 　　检测RNA的大小和状态 RNA电泳 转印 杂交 洗膜 显色 二、组织、细胞的原位杂交 用标记的核酸探针与组织切片或细胞涂片中的核酸进行杂交并对其进行检测和定位的方法 三、菌落与噬菌体斑的原位杂交 平皿 膜－－杂交 培养 第11章 PCR技术的原理和应用 PCR：Polymerase chain reaction Mullis: 1983发明， 1993获诺贝尔奖 Sarki:1985将PCR用于镰刀红细胞贫血　　　的诊断。 Erlich: 分离纯化了适用于PCR的Tag酶 一、常规多聚酶连反应 （一）原理： PCR是体外酶促合成特异ＤＮＡ片段的方法。由高温变性、低温退火及适当温度延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的ＤＮＡ得以迅速扩增。 变性----退火------延伸-----延伸 30-35循环 94 °c 55 °c 72°c 5’ 3’ 5’ 3’ 变性 退火 延伸 第二循环 （二）PCR 的特点 １。操作简单 ２。省时：1-2 hr ３。灵敏度高：pg ４。特异性强 ５。对原始材料质量要求低 ６。有一定程度的单核苷酸错误掺入 （三）影响ＰＣＲ的因素 １、模板：ng量的克隆DNA或?g的染色 体DNA ２、引物：特异性应强 ３、Mg2+浓度: 1.5-2 mmol/L量 ４、dNTP 的浓 度: 单核苷酸浓度 200umol/L 5、 Taq DNA聚合酶的用量:100?l 反应液 中加入2。5U的酶 ６、循环参数：；25-35 PCR引物的设计 １、上游引物与目的DNA５’端序列完全相同；  下游引物与目的DNA３’端序列互补 ２、引物长度以15-30个碱基为益； G+C含量为45-55％ ３、避免引物内形成二级结构 ４、两引物间不应发生互补，特别是在３’端， 避免形成引物二聚体 ５、合成的引物应进行纯化 ６、引物的浓度不要太高: 0.1-0.5 ?mol/L 引物的设计 目的ＤＮＡ：５’－ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC CGC ACT TCG GAC-----------------CTC CTA AGA CAC TCT CTA CAG-3’ 上游序列：５’－ ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC －３’ G+C=11/21=52% 下游序列：５’－CTG TAG