透射免疫比浊法-雅安职业技术学院.PPT

第六章免 疫 比 浊 分 析 在抗原或抗体量一定的条件下，可以利用比浊仪在光源的光路方向上测定透射光强度与入射光强度的比值或吸光度，来判断待测抗原的量，这种方法称为透射比浊法 。 待测的抗原抗体复合物分子量足够大。 抗原抗体复合物数量足够多。 具有充分的反应时间。 高亲和力的抗体，并保证抗体过量。 透射免疫比浊法的灵敏度是单向琼脂扩散方法的5～10倍，但其与标记免疫分析技术相比还不够高。因此，透射比浊类的自动分析仪用于免疫测定已趋减少，该测定原理主要用于生化分析仪。 其中光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物的大小和多少密切相关。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测的抗原越多，形成的复合物越多，散射光就越强。 应选择适当的光源强度、反应时间、测量角度及光源的波长。另外，要注意保证抗原浓度合适。此外，还要选择适宜的离子强度、pH值等。 散射免疫比浊法是当今免疫化学分析中比较有优势的方法。可以实现自动化管理，但用于免疫沉淀反应有很多缺陷，如因为是一次性测定光吸收值，没有考虑单个待测样本的散射效果，可能使测定结果不准确。 测定的时间依然较长，且随时间延长，抗原抗体复合物有重新结合的趋势，可影响散射值的变化及存在反应本底，在微量测定时，本底的干扰是影响测定准确性的重要因素。 当抗体的浓度固定于一定范围时，速度峰值的高低与抗原的含量成正比，随着时间的延长，免疫复合物的量逐渐增多，抗原抗体结合速度的峰值在一定的时间出现。通过微机处理即可得到待测蛋白成份的含量。 速率散射比浊法峰值出现的时间与抗体浓度及纯度直接相关，需选用抗体纯度及亲和力交高的试剂。此外，要保证待测样本血清的性状符合要求，如严重脂血等即为不合格样本。 该法具有快速、敏感度及精密度高的特点，其最大优点在于快速，检测不必等到抗原抗体达到平衡，大大节省反应时间，每小时可检测标本数十份；敏感度高，最小检出量达微克/升水平。 单个胶乳颗粒在入射光波长之内并不阻碍光线透过，两个及其两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过的光减少，其减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，即与待测抗原量呈正比，由此可检测样本中的特定抗原含量。 胶乳颗粒的均一性将直接影响光散射作用，影响检测结果，因此需要选择均匀一致的胶乳颗粒。此外，试剂需要加保护剂以提高其稳定性，所用器皿要洁净，避免杂质微粒的干扰。 该法敏感度高，试剂稳定，个体免疫复合物对结果影响也小，因此结果稳定、可靠，特异性好，精确度高，且不需要特殊的仪器设备，一般分光光度计、自动化生化分析仪或散射比浊仪均可使用。 系统由分析仪、计算机、条码读取器、打印机四部分组成，其中分析仪是主要组成部分，包括散射测浊仪、自动加样系统、运输装置和比色杯装置。 ARRAY系统由分析仪、电脑处理系统、打印机构成，其主要构成部分为分析仪，由加液系统、散射测浊仪、40孔样本转盘、20孔试剂转盘、软盘驱动器等组成。 目前，透射免疫比浊法和散射免疫比浊等方法已常规运用于临床特定体液蛋白质的检测，相关仪器已广泛应用于国内各级医院，成为临床免疫检测的重要手段之一。 二、免疫比浊分析的主要影响因素 1．抗原抗体比例 抗原抗体比例要适当。 2．抗体的纯度与效价 诊断试剂应尽可能选择高纯度与高效价的抗体。 3．免疫复合物的大小及稳定性 溶液中免疫复合物颗粒的分散度尽可能相同，颗粒应该不容易相互聚集。 4．增聚剂 利用增聚剂破坏抗原抗体的水化层，促进反应的进行。 5. 离子强度 PBS是较好的反应液 。 返回章目录 小 结 经典的免疫沉淀反应通常是在抗原抗体反应的终点进行结果判断，存在操作繁琐、费时、敏感度低及难以自动化等缺陷。自动化免疫比浊分析仪器的问世解决了以上的诸多问题。 返回章目录 * * 目　录 第一节 免疫比浊技术原理 第二节 自动化免疫比浊分析 第三节 小结 第一节 免疫比浊技术原理 免疫比浊技术分类： 透射免疫比浊法 （turbidimetric immunoassay） 散射免疫比浊法 （nephelometry immunoassay） 速率散射比浊法 终点散射比浊法 一、透射免疫比浊法 当一定波长的光通过抗原抗体反应形成的免疫复合物时会因为反射和吸收而减弱，一定范围内，透射光被吸收的量与复合物的量呈正相关关系，而复合物的量与抗原抗体量为一定的函数关系。 （一）基本原理 透射免疫比浊法光路图 （二）技术要求 （三）方法学评价 抗原抗体反应曲线 二、散射免疫比浊法 散射比浊法是指一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液时遇到其中的抗原抗体复合物，光线