基于抗坏血酸过氧化酶的电镜成像和活细胞邻近标记方法的应用进展.PDF

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2018, 45(5): 519~528 基于抗坏血酸过氧化酶的电镜成像和活细胞 邻近标记方法的应用进展* 1)** 1)** 2)** 2) 3) 2) 2) *** 晓君 朱新宇 张 蕊 薛艳红 李真珍 宋婀莉 侯俊杰 1) 2) ( 华中科技大学生命科学与技术学院，武汉430074； 中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室，北京100101； 3) 郑州大学第一附属医院肾内科，郑州450052) 摘要 Alice Ting 实验室开发的抗坏血酸过氧化物酶(engineered ascorbate peroxidase，APEX) ，相对于经典的辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase，HRP) ，其酶活性不再受细胞内蛋白质定位的影响，可以在几乎所有的亚细胞区域保持活性，这使其 在研究亚细胞尺度以及活细胞水平生物学问题时极具优势 目前，基于APEX 的二氨基联苯胺(diaminobenzidine ，DAB)染色 标记技术已经成功地实现对全细胞、亚细胞器和蛋白质水平的电镜成像 同时，与质谱技术结合，基于APEX 的活细胞生物 素邻近标记方法也极大地推动了亚细胞器蛋白质组学，以及目标蛋白在特定时空条件下邻近蛋白质组学的研究发展 本文将 从以上两个方面阐述APEX 技术的基本原理及最新应用进展，并讨论和展望其在实际应用中存在的局限性和挑战 关键词 抗坏血酸过氧化物酶，二氨基联苯胺染色标记，电镜，邻近标记，蛋白质组，蛋白质相互作用 学科分类号 R6 ，R7 DOI: 10.16476/j.pibb.2017.0362 与质谱技术良好的兼容性 [3] 蛋白质的亚细胞定位对其发挥特异的生物学功 Pagliarini 等 在这一成 能是至关重要的，但由于缺乏有效的研究手段，在 果发表不久就 以 “Hallmarks of a new era in 亚细胞器尺度研究蛋白质定位与功能的关系仍然是 mitochondrial biochemistry ”为题回顾了线粒体研究 极具挑战性的科学技术难题 2012 年，美国科学 的历史并认为Ting 实验室的这一研究开创了线粒 家Alice Ting 实验室通过位点突变的方法改造野生 体研究的新纪元 2015 年，该实验室利用酵母表 型抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase， 面展示技术进一步对APEX 进行改良，得到活性 APX) ，筛选获得了单体性好、催化活性高的APX 更好的升级版APEX2 [4] 同年，Nature Methods 的 (enhanced APX) ，即APEX [1] 这种新型的抗坏血 技术编辑Marx [5]在 “Technology Future ”专栏为基 酸过氧化物酶，相对于经典的辣根过氧化物酶 于 APEX2 的蛋白标记技术撰写了主题文章 (horse radish peroxidase，HRP) ，其酶活性不再受细 “Mapping proteins with spatial proteomics ”，重点展 胞内蛋白质定位的影响，可以在几乎所有的亚细胞 望了该技术在亚细胞器蛋白质组学领域巨大的应用 区域保持活性 他们利用基于