《信号转导研究方法》-(课件).ppt

* * ProteinG-Sepharose * RNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光 RNase protection assay (RPA) Sensitive and quantitative alternative to Northern blots for the measurement of gene expression levels. Labelled antisense cRNA is transcribed from a DNA clone in an appropriate vector, hybridized with an mRNA sample, and single stranded RNA digested away with RNase, then run out on a gel. The amount of labelled RNA surviving is directly proportional to the amount of target mRNA present in the sample. 萤火虫荧光素酶(firefly luciferase) (Luc) 荧光素酶可以催化荧光素luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光。然后通过荧光测定仪(luminometer)或液闪测定仪就可以测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在luciferase的上游或其他适当的地方，构建报告基因质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。 内参基因：通常是管家基因，很少变化。 长双链RNA被细胞源性的双链RNA特异的Ｄｉｃｅｒ核酸酶切成２１～２３个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA 小干扰性RNA与细胞源性的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体，该复合体可识别与小干扰RNA有同源序列的ｍRNA，并在特异的位点将该ｍRNA切断。 转基因： 1）将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，称之为转基因。 转基因动物： 所谓转基因动物就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。 基因敲除（knock-out） 采用同源重组的方法,用体外合成的无效基因或突变基因取代相应正常基因,再应用转基因方法孵育出转基因动物,即为基因敲除动物。 * 如何确定某种因子在信号传导通路的上游或下游？ 将两种因子A和B分别做基因沉默，沉默A gene 看看A和B表达的情况，然后沉默B gene 再看看A和B表达的情况。上游的因子被沉默表达后，下游的因子肯定表达下调或不表达。而下游因子被沉默表达后，上游因子的表达不会受影响。还可以做个免疫共沉淀，看看上游因子是不是直接结合（作用）于下游因子的基因启动子区，开启下游表达。如若不是，可能另有其他的环节在中间发挥作用。 * 以光线激发后，供体荧光基团(ECFP–X)会将激发能量转移至距离10–100 ? 以内的受体荧光基团(EGFP–Y)，使之发出荧光。通过检测受体荧光基团激发的荧光即可确认两蛋白质间的相互作用。ECFP：强化型蓝荧光蛋白；EGFP：强化型绿荧光蛋白 FRET 3. 磷酸化蛋白质研究方法: Western blot with phospho-specific antibodies. ELISA Phosphopeptide and phosphoamino acid analysis by mass spectrophotometric analysis. 激酶活性的测定 　　信号转导过程中往往涉及多种激酶的活化，因而对这些激酶活性的测定在信号转导研究中具有重要意义。常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。 4. 基因转录活性检测 信号蛋白转录水平表达（mRNA）的检测: RT- PCR / Realtime RT- PCR Northern blot analysis. “gene chip” to measure changes in gene expression at larger scales. 基因启动子/增强子转录活性的检测: Transient or s