蛋白质工程在食品工业中的应用资料讲解.ppt

第二节 蛋白质工程与食品加工 葡萄糖异构酶（GI），又称D-木糖异构酶，属微生物酶类。1957年最早在嗜水假单胞菌中发现其活性，后来又发现近百种细菌和放线菌能合成该酶，其中绝大多数为胞内酶，只有极少数菌株能分泌胞外酶。葡萄糖异构酶能将D-葡萄糖、D-木糖和D-核糖等催化为相应的酮糖。在体外一定条件下，它也能催化D-葡萄糖转化为果糖，因而成为工业上制备高果糖浆（HFCS）的关键酶；它还可用于含木聚糖类物质发酵生产乙醇，是一种具有重大经济价值的工业用酶。 一、葡萄糖异构酶（EC5.3.1.5） 1967年美国成功地进行了GI的工业化应用，以后西方国家主要的淀粉加工业都转向GI技术生产。各国又竞相利用生物高技术改造GI的结构、性质和功能，以提高该酶的适应性，扩大应用领域。由于葡萄糖异构酶有较好的耐热性，结构也较稳定，使它成为目前国际上公认的研究蛋白质结构与功能关系，建立完整蛋白质工程技术的最好模型之一。 （一）葡萄糖异构酶的基本性质 葡萄糖异构酶能催化D-葡萄糖异构化生成D-果糖，也可将木聚糖异构化为木酮糖，此外还能以D-核糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖及葡萄糖3、5、6碳的修饰衍生物为催化底物，但是它只能催化D-葡萄糖或D-木糖的α-旋光异构体，而不能催化β-旋光异构体。 葡萄糖异构酶的最适温度一般在70-80℃，最适pH7.0-9.0，微偏碱性，不同种属来源的酶有一定的差别。葡萄糖异构酶的最适温度、最适pH值及稳定性还受到缓冲液种类、底物浓度、激活剂、稳定剂及反应时间的影响。另外二价金属离子对酶活力、稳定性及酶的专一性都有影响。 各种属来源的葡萄糖异构酶在结构上都有一定的相似性。其一级结构的同源性随种属关系远近不同而不同。但有40个恒定氨基酸残基，其中包括14个残基与酶活性中心有关。葡萄糖异构酶晶体的空间结构一般都是紧密的四聚体，单体相对分子质量约4万-5万，单体间符合222点对称分布。单体由一大一小两个结构域构成，近N端的主结构域是由8股右手的α/β型桶构成，两个同轴圆柱中，内柱由8条平行的β-折叠股构成，外柱由8股与β-折叠交替相邻α-的螺旋构成, α-螺旋与β-折叠构成反平行；C端的小结构域由几段α-螺旋无规则卷曲成一个远离N端的环状结构，参与单体内的相互作用及活性部位的构成（图）。 葡萄糖异构酶的活性中心位于每个单体平行β桶近C端的口部，是深陷的口袋状，有两个二价金属离子结合位点，与保守的氨基酸残基侧链基团以及溶剂中的氧原子形成配位键，周围有一个高度疏水背景区，构成的氨基酸侧链不只由一个单体提供，两个单体相聚成无活性或活性微弱的二聚体，只有形成四聚体时才具有全部酶活。葡萄糖异构酶的催化作用采用的是金属离子介导的负氢离子转移机制（图）。 葡萄糖异构酶的基因组织和调控主要是由木糖操纵子控制。由木糖透性酶基因（xylt）、木糖异构酶基因（xyla）、木糖激酶基因（xylb）和调节基因（xylr）构成木糖操纵子的主要成分。 （二）葡萄糖异构酶的蛋白质工程 直接发酵生产的GI应用在工业生产中，已经取得了令人瞩目的成功，但仍存在一定局限性，如最适pH值为碱性、高温下稳定性还有待提高等。偏碱性条件下糖不稳定易焦化，使总产率下降；高温条件有利于反应进程的加快和平衡点的向果糖方向移动，因此对GI进行定向改造成为客观迫切的需求，而蛋白质工程技术，可在研究GI结构－功能关系的基础上，通过对某些氨基酸的替代和修饰，改变GI的结构性质，改善其工业应用性能。 第六章蛋白质工程原理及其在食品加工中的应用 主要包括：分子遗传学、蛋白质结构功能相关的理论与技术。 分子遗传学：完整cDNA的克隆技术、DNA序列的快速测定技术、DNA序列推测蛋白质序列的多维程序系统、原核生物及真核生物基因表达过程的调控、基因的定位诱变及随机诱变理论与技术等。 蛋白质结构功能分析：蛋白质一级结构－氨基酸序列的分析；X光单晶衍射结构分析技术；两维和三维核磁共振结构分析技术；蛋白质结构数据库的建立；蛋白质功能的酶学和免疫研究技术；蛋白质分子力场、能态、自由能等生物物理学研究技术；计算机模拟处理结构分析系统等。 两大类理论与技术相互关联、相互促进，借助其他多类学科的支持，完成对蛋白质分子结构与功能分析、归类，进一步展开突变蛋白质的分子模拟与预测，实现蛋白质的改造，以及全新蛋白质的分子结构与功能的设计，在计算机模拟的基础上，进行蛋白质分子的化学修饰、合成的实际操作，验证分子设计的结果，获得具有特定结构、性质和功能的目的蛋白质。 二、蛋白质工程的原理 （一）蛋白质工程的目的 对目的蛋白质进行结构和功能上的设计与改造，以满足人们特定条件下的需要。以蛋白质