柑橘流式细胞仪倍性鉴定-Bio-protocol.PDF

/e1010192 DOI:10.21769/BioProtoc.1010192 柑橘流式细胞仪倍性鉴定 Identification of Citrus Ploidy by Flow Cytometry # # # 袁东亚 ，解凯东 ，王惠芹 ，郭文武* 园艺植物生物学教育部重点实验室，园艺林学学院，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：guoww@ #共同第一作者 引用格式：袁东亚，解凯东，王惠芹，郭文武. (2018). 柑橘流式细胞仪倍性鉴定. Bio-101 e1010192. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010192. How to cite: Yuan, D. Y., Xie, K. D., Wang, H. Q. and Guo, W. W. (2018). Identification of citr us ploidy by flow cytometry. Bio- 101 e1010192. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010192. (in Chinese) 实验原理及目的：流式细胞仪 (Flow cytometer) 是一台自动分析细胞的高端技术设备， 其原理是悬浮在液体中的携带染料分子的细胞一个个地依次通过测量区，当每个细胞通 过测量区并被激发光照射时产生荧光信号，然后被光电倍增管 (PMT) 接收并转化成电 信号，这些信号代表荧光强度和细胞数量。电信号被电子-数字转换器转换成数字信号后 传输并储存于计算机硬盘中，再通过流式细胞仪软件将这些数字信号模拟成图形显示出 来。于是细胞的定性和定量数据就被快速地、大量地测定。在育种工作中，流式细胞仪 被普遍的应用，因为传统的染色体计数方法比较繁琐，特别是对于染色体数多的物种， 倍性分析更为困难。而流式细胞仪可快速精准的检测物种的倍性，缩短了时间，节省了 人力。 关键词：流式细胞仪，信号，倍性 材料与试剂 1. 塑料皿 2. 滴管 3. 微孔滤膜 4. 样品管 5. 新鲜叶片或愈伤 6. 冰盒 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010192 DOI:10.21769/BioProtoc.1010192 7. 灭菌水 8. Precise T 试剂盒 9. DAPI 10. 清洗液 11. 细胞裂解溶液 (A 液) (见溶液配方) 12. DAPI 染色液 (B 液) (见溶液配方) 仪器设备 1. 镊子 2. 单面刀片 3. 4 °C 冰箱 4. 流式细胞仪 (Partec, model: space) 5. 移液器 实验步骤 1. 前期准备工作 1.1 样品准备：于实验前取待测样品的新鲜幼嫩叶片或愈伤组织为实验材料，包括 样品的对照 (一般为二倍体)。 注： 1) 若在室外取样，需放在冰盒内；若不能立即进行检测，需放在4 °C 冰箱 保持叶片活力。 2) 一般来说，新鲜幼嫩的叶片容易检测且结果峰图明显，无杂峰干扰，但对 于茶叶来说，幼嫩叶片酚类多，易被氧化，老叶更好。所以检测时，要清 楚不同物种叶片的特性。 1.2 开机前检查：检查流式细胞仪鞘液 (Sheath) 瓶和废液 (Waste) 瓶的液面情况， 确保每次运行的鞘液 (超纯水) 充足，如鞘液不足，需添加提前灭过菌的超纯水 (瓶中鞘液总体积不能超过1,800 ml)，扭紧瓶盖，防止漏气。每次关机后，及时 清理废液，避免长菌。 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2 /e1010192 DOI:10.21769/BioProto