非小细胞肺癌患者DAPK基因甲基化研究与去甲基化对肺癌细胞生物学行为的影响生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

安徽医 安徽医科大学硕士学位论文 英文缩略词对照表 （Abbreviation） 英文缩写 5-Aza-CdR 英文全称 5-Aza-2′-deoxycytidine 中文全称 5-氮杂-2′-脱氧胞苷；地西他滨 AI Amp bp apoptosis index ampicillin base pair 凋亡指数 氨苄青霉素 碱基对 cDNA complementary deoxyribonucleic acid 互补脱氧核糖核酸 CS DAPK DEPC DMSO DNMT dNTP EB EDTA MSP MF MR NSCLC OD PBS PCR rpm Calf serum Death-associated protein kinase Diethyl pyrocarbonate Dimethyl sulfoxied DNAmethyltransferase deoxynucleoside triphosphate ethidium bromide Ethylendiaminetetra-acetic Acid Methylation specific PCR Methylation forward primer Methylation reverse primer Non-small-cell carcinoma optical density Phosphate buffer saline polymerase chain reaction rotation/minute 新生牛血清 死亡相关蛋白激酶 二乙基焦磷酸胺 二甲亚砜 DNA 甲基转移酶 三磷酸脱氧核苷 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 甲基化特异性聚合酶链反应 甲基化前引物 甲基化后引物 非小细胞肺癌 光密度 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应 转/分钟 RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction 逆转录聚合酶链反应 TAE TE Tris Acetic acid EDTA buffer Tris-Hcl EDTA buffer 乙酸，乙二胺四乙酸缓冲液 盐酸三（羟甲基）氨基甲烷， 乙二胺四乙酸缓冲液 Tris Tris（hybromymethy） aminomethane 三（羟甲基）氨基甲烷 UF UR Unmethylation forward primer Unmethylation reverse primer 非甲基化前引物 非甲基化后引物 PAGE PAGE 1 非小细胞肺癌患者 DAPK 基因甲基化研究与及去甲基化 对肺癌细胞生物学行为的影响 研究生 宋 超 导 师 薛绍礼 摘 要 目的 探讨在非小细胞肺癌（NSCLC）患者的血浆中死亡相关蛋白激酶（DAPK） 基因启动子区异常甲基化检测的临床意义，以及去甲基化药物5-Aza-CdR对DAPK 基因甲基化产生的影响。方法 在第一部分实验中，我们用巢式甲基化特异性聚合 酶链反应（nMSP）检测了112例NSCLC患者肺癌组织、癌旁组织、外周血血浆和 112例正常对照组血浆样品中DAPK基因的甲基化情况，并比较各组的检测结果。 在第二部分实验中，我们用不同浓度及作用时间的5-Aza-CdR处理了体外培养的 A549细胞，MTT法检测5-Aza-CdR对细胞增殖的抑制率，Cell scratch test法观察 5-Aza-CdR对A549细胞迁移能力的影响，MSP及逆转录PCR（RT-PCR）检测用药 前后A549细胞中DPAK基因甲基化状态及其mRNA表达情况的变化。结果 癌组织 DAPK基因甲基化率为59.8%，高于癌旁组织的8.0%（P＜0.001），其中鳞癌、腺 癌和腺鳞癌癌组织和癌旁组织间的甲基化检出率比较均有显著性差异(P＜0.001)； 患者血浆中DAPK基因甲基化检测率为21.4%，对照组血浆未检测到DAPK基因甲基 化（P＜0.001）；血浆中DAPK基因甲基化检出率与NSCLC临床分类、临床分期和 病理类型无明显相关性。在1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L的5-Aza-CdR处理 人腺肺癌A549细胞24、48、72、96、120小时后，细胞增殖均受到不同程度的抑制， 有时间和剂量的依赖性；其中1×10-5、1×10-6mol/L浓度组的5-Aza-CdR 处理72小时 后的A549细胞相比正常对照组A549细胞迁移能力有明显下降；在5-Aza-CdR处理 前未检测到A549细胞中DAPK基因的mRNA表达，经过不同浓度5-Aza-CdR处理72 小时后，DAPK基因在A549细胞中甲基化状态呈现出了逆转，同时mRNA重新获得 表达。结论 用nMSP法检测血浆样本中DAPK基因甲基化