泛素化和苏素化修饰对α-突触核蛋白降解的影响-神经生物学专业论文.docx

THE EFFECT OF UBIQUITINATION AND SUMOYLATION MODIFICATION ON α-SYNUCLEIN DEGRADATION A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science By Nannan Wei Supervisor: Prof. Jianshe Wei Date: May, 2015 I I PAGE PAGE IV 摘 要 α-突触核蛋白(α-Synuclein, α-Syn)是一种包含有 140 个氨基酸的小分子酸性蛋白质。 α-Syn 普遍存在于脑部神经元内。α-Syn 基因的缺失或突变，会引起多种神经疾病，特 别是诱发常染色体显性遗传性帕金森病。然而，α-Syn 突变体诱发帕金森病的确切机制 在很大程上仍未有明确定论。 蛋白质翻译后修饰与神经退行性疾病的关系是近年来的研究热点，尤其是对蛋白质 的苏素化(SUMOylation)、泛素化(Ubiquitination)以及磷酸化(phosphorylation)的研究。但 α-Syn 的苏素化、泛素化与 α-Syn 降解过程的研究报道较少。因此，这项研究中，我们 主要探讨苏素(Small ubiquitin-related modi?er protein, SUMO)和泛素(Ubiquitin)在 α-Syn 降解途径中的作用，揭示 SUMO 和 Ubiquitin 对 α-Syn 的降解通路转换的影响。研究结 果将丰富帕金森病发病过程中蛋白质降解的机理。 本实验首先用两步法 PCR 技术构建带有 Flag 标签的野生型和突变型 Ubiquitin 真核 表达质粒，即 Flag-Ubiquitin WT、K29A、K48A、K63A 以及双突变型 G75AG76A。通 过双酶切和基因测序确定序列的正确性；通过 Western Blot 方法确定重组质粒在细胞上 的表达；通过免疫荧光标记技术了解野生型和突变型 Flag-Ubiquitin 在细胞内分布特征； 通过 LDH 和 WST-1 的检测分析野生型和突变型 Flag-Ubiquitin 的细胞毒性。发现野生 型和突变型 Flag-Ubiquitin 多分布于细胞胞浆，但在细胞核内也有少量分布。突变型 Flag- Ubiquitin 均有不同程度的细胞毒性，其中 Flag-Ubiquitin G75AG76A 的毒性最大。 其次，B103 细胞分别瞬时转染 α-Syn WT 和 A53T 质粒，然后用浓度为 200 μg/mL 的 Hygromycin B 建立具有抗性筛选的稳定表达 α-Syn WT、A53T 的两种 B103 细胞株。 最后，在稳定表达 α-Syn WT 和 A53T 的 B103 细胞株上，分别瞬时转染重组质粒 Flag-Ubiquitin，通过免疫荧光标记分别检测 α-Syn 与 SUMO、Ubiquitin 以及与 26S 蛋 白酶体定位结合情况。结果发现在 B103 细胞内，Ubiquitin 与 SUMO 无明显共定位现 象，而在稳定转染 α-Syn 的细胞内，却发现 α-Syn 与 Ubiquitin、SUMO 和 26S 蛋白酶体 以及 Ubiquitin 与 SUMO 均有明显的共定位现象，修饰的 α-Syn 一部分由泛素介导的蛋 白酶体系统降解。 总之，突变型 Flag-Ubiquitin 产生的细胞毒性不同，这与它们在细胞内的分布特征 以及形成的聚集体有很大关系。α-Syn 能同时与 Ubiquitin 和 SUMO 结合，被泛素和 SUMO 修饰，形成 α-Syn 的泛素复合物以及 α-Syn 的 SUMO 复合物，并且在 Ubiquitin 与 SUMO 两者之间，可能存在着某种机制能够使 Ubiquitin 与 SUMO 相互作用共同修饰 α-Syn，修饰的 α-Syn 一部分经由泛素介导的蛋白酶体系统降解。 关键词：帕金森病，α-突触核蛋白，苏素，泛素，泛素蛋白酶体系统 III III PAGE PAGE IV ABSTRACT α-Synuclein (α-Syn), a small molecules acidic protein, contains 140 amino acids, in which nearly disperses in the brain neurons. Deletion or mutation of α-Syn gene causes