5氮杂胞嘧啶对胃癌细胞系SGC7901RUNX3基因表达的效应.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 摘 要 研究背景与目的 胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，胃癌发生的机制并未完全阐明。肿瘤的发生发 展是一个多步骤过程。一般来说，肿瘤的发生与遗传学和表观遗传学密切相关，DNA 甲基化是重要的表观遗传学修饰。肿瘤的发生发展过程中，会出现一个 DNA 甲基化状 态的转变，一些启动子区域的 CpG 岛被甲基化，导致启动子区域所在的基因的表达沉 默，这个过程是肿瘤发展的关键步骤。人类的细胞中，70–80%的 CpG 二核苷酸是高甲 基化的。然而 CpG 岛应该是非甲基化的，人类有大约 60%的基因与 CpG 岛有关。正常 非甲基化 CpG 岛的异常甲基化与基因突变、基因缺失的作用一样，均与转录失活有关。 胃癌存在许多抑癌基因启动子不同程度的高甲基化。非甲基化的 CpG 岛在肿瘤细 胞可能转变为甲基化的 CpG 岛，并导致基因功能丧失。RUNX3 基因位于染色体 1p36.1。 RUNX3 基因的表达产物与 Smad 结合，协同调节多个靶基因。人类 RUNT 相关转录因 子是 TGF-β 超家族信号的重要靶点。在哺乳动物 Runt 结构域转录因子家族包括 3 个成 员，分别是 RUNX1、RUNX2 和 RUNX3，它们 1 个共同的氨基末端结构域。前两个成 员分别与人类急性白血病和锁骨发育不良等疾病相关。 RUNX3 作为 RUNX 转录因子家族成员，具有抑癌基因的功能。RUNX 3 是新型的 抑癌基因，RUNX3 在胃癌中常因启动子高甲基化而沉默。近期的研究表明，胃癌细胞 RUNX3 表达由于启动子高甲基化或杂合子缺失而明显下调。 5 氮杂胞嘧啶 （5-Aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-dC）是特异性 DNA 甲基转移酶抑制剂，可逆转因高甲 基化而沉默的基因。本研究应用甲基化特异性 PCR（methylation specific PCR, MSP）技 术检测 5-Aza-dC 对胃癌细胞 SGC-7901 RUNX3 CpG 岛的甲基化状态的效应，应用 Real-time-RT-PCR 技术检测其对 RUNX3 mRNA 水平的效应，应用流式细胞技术（flow cytometry, FCM）检测其对细胞周期的效应，探讨 5-Aza-dC 是否可逆转 RUNX3 CpG 岛 的高甲基化，恢复 RUNX3 基因的功能。 I 研究方法 1．细胞培养：胃癌细胞系 SGC-7901 培养于含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液中， 37℃，50ml/L CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养。每 1d 换液 1 次，每 3d 传代 1 次。 2．5-Aza-dC 对胃癌细胞 SGC-7901 RUNX3 基因启动子 CpG 岛甲基化状态的效应：以 12μmol/L 的 5-Aza-dC 培养胃癌细胞 SGC-7901 72 h，提取基因组 DNA，应用甲基化 特异性 PCR（methylation specific PCR, MSP）技术检测 5-Aza-dC 对 RUNX3 基因启 动子 CpG 岛甲基化状态的效应。 3．5-Aza-dC 对胃癌细胞 SGC-7901 RUNX3 基因 mRNA 的效应：分别以 1.5μmol/L、 3μmol/L、6μmol/L 和 12μmol/L 的 5-Aza-dC 培养胃癌细胞 SGC-7901 72 h，提取各组 细胞总 RNA，应用 Real-time-RT-PCR 技术检测 5-Aza-dC 对胃癌细胞 SGC-7901 RUNX3 mRNA 的效应。 4．5-Aza-dC 对胃癌细胞 SGC-7901 细胞周期的效应：分别以 1.5μmol/L、3μmol/L、 6μmol/L 和 12μmol/L 的 5-Aza-dC 培养胃癌细胞 SGC-7901 72 h，收集细胞，应用 FCM 技术检测 5-Aza-dC 对胃癌细胞 SGC-7901 细胞周期的效应。 5．统计学处理：所有数据以均数±标准差( x ± 数据， P＜0.05 为差异有显著性。 结果 s )表示，应用 SPSS18.0 统计软件处理 1. 5-Aza-dC 对胃癌细胞 SGC-7901 RUNX3 基因启动子 CpG 岛甲基化状态的效应： MSP 结果显示，胃癌细胞 SGC-7901 RUNX3 基因启动子 CpG 岛为甲基化状态； 12μmol / L 的 5-Aza-dC 作用 72h 后，RUNX3 基因启动子 CpG 岛由甲基化状态转变 为非甲基化状态。 2. 5-Aza-dC 对胃癌细胞 SGC-7901 RUNX3 基因 mRNA 的效应：Real-time- RT-PCR 结 果显示，胃癌细胞 SGC-7901 RUNX3 mRNA