根癌农杆菌.PPT

2.5 植物基因工程 截至2009年底，全球已有25个国家批准了24种转基因作物的商业化应用。 2009年我国种植的转基因农作物主要是棉花。 2010年4月2日：2009年第三批安全证书中，181个项目中有172个是棉花。 苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白，家畜、人类食用了，是否安全？ Contents 农杆菌介导法 目前研究最多、理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径 是当前植物基因工程最常用的方法 背景介绍 根瘤菌科，农杆菌属（Agrobacterium）： ——革兰氏阴性菌，侵染植物伤口进入细胞后，将T-DNA插入植物基因组中，导致植物产生冠瘿瘤或毛状不定根，干扰植物的正常生长 －根癌农杆菌（A. tumefaciens）Ti质粒(tumor-inducing plasmid) （广泛使用） －发根农杆菌(A. rhizogenes)Ri质粒(root-inducing plasmid) Ti plasmid Ti（tumor-inducing plasmid）质粒：根癌农杆菌含有一种内源质粒，大小因种类而异，在200－250kb之间。当农杆菌同植物接触时，Ti质粒中有一段DNA，大约在15kb-30kb，称为T-DNA（transfer-DNA），能转移并整合到植物基因组中，并导致冠瘿瘤的形成。 Ti质粒分为4个功能区： Con区：与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移 Ori区：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我复制。 边界序列 T－DNA左右两端边界各有一个25bp长的正向重复序列(左边界(left border, LB) ，右边界(right border, RB))，在不同Ti质粒中高度保守。它在T-DNA的切除及整合过程具有重要意义。右边界的存在对外源基因整合到植物基因组中相当重要，但左边界则非必须。 外源基因在Ti质粒介导转化到植物的过程(T-DNA的转移过程) 农杆菌吸附于植物的表面伤口部位 受酚类物质（乙酰丁香酮或羟基乙酰丁香酮）的诱导，vir区基因被激活，virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列和LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝（T-链） T-链在RB序列的引导下定向穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中 T-DNA在植物细胞中表达 Ti质粒介导转化植物细胞示意图 根癌农杆菌介导转化植株的基本程序 可简单分为三大部分研究工作 受体系统的建立（组织培养体系） Ti质粒转化载体的构建 目的基因的转化 Ti质粒介导转化植物的优缺点 优点： －自然界天然存在的基因工程，转化效率高 －主要以单拷贝或低拷贝形式插入，利于后代的纯化和稳定遗传 －不需要特殊的专用设备 缺点： －只能以T-DNA插入的方式导入寄主细胞，没有方向性 1.2 基因枪法（particle gun） 也称微弹轰击法：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，从而实现基因的转化。 可将基因枪分为三种类型： 第一类是以火药作为动力； 第二类是以高压气体作为动力； 第三类是以高压放电作为动力。 2 植物基因工程的应用 提高植物的农业价值（产量、品质、抗性）和园艺价值（花色、花形、花期），eg. 抗虫棉、转基因矮牵牛等； 作为生物反应器生产某些重要蛋白质和次生代谢物质，eg. 生长激素、干扰素、白介素-2、 乙肝疫苗、表皮生长因子等； 研究基因在发育及其他生理生化过程与代谢途径中的作用 3 转基因植物的安全性问题 环境安全性：包括转基因植物的扩散、转入植物的外源基因的扩散、转入植物的其他标记基因的扩散、转基因植物是否会影响生物多样性、转基因植物是否会改变与之相关物种（如害虫）的进化速度、转基因植物中标记基因的毒性问题； 核心问题是：是否会发生基因漂移、是否会破坏自然生态环境，打破原有生物种群的动态平衡。 食品安全性：其食用部分是否会引起食用者产生不良反应(过敏)，有无累积效应； 经合组织1993年提出了食品安全性评价的实质等同性原则。如果转基因植物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。 应对措施 设置缓冲作物带； 设置隔离区； 质粒构建时尽量避免使用抗性基因或发展无选择标记的转化系统； 转基因作物与未转基因作物隔年轮作； 小结：植物基因工程的主要内容 目的基因的获得 构建合适的植物表达载体 通过合适方式的介导（农杆菌介导、基因枪、PEG介导、病毒载体介导等），将其转化到植物受体细胞（创伤部位、原生质体、叶片组织等），并整合到染色体基因组上 使携带外源基因的植物细胞或组织再生成形态正常的健康可育的植株 外