非小细胞肺癌预后相关评价标志物筛选-临床医学专业论文.docxVIP

摘 摘 要 摘 要 背景：肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在国内和国际上已位居各 种恶性肿瘤的首位。其中非小细胞肺癌占肺癌的 80%。造成肺癌死亡率居高不下的最主 要的原因是缺少准确的早期诊断及有效的治疗效果监测手段。由于肺癌早期没有明显症 状，80%以上的肺癌患者到医院就诊时已属晚期，失去了外科手术和多学科根治治疗的 最佳时机。加之肺癌的预后较差，总体 5 年生存率只有 10-15%。即便是 I 期的非小细胞 肺癌（Non Small Cell Lung Cancer，NSCLC），手术治疗后仍有约 30％的患者死于肿瘤 复发和(或)转移。自身免疫抗体是机体免疫系统针对以基因结构和功能异常为实质的一 系列病理变化所产生的免疫应答产物。作为一种新型的肿瘤标志物，自身免疫抗体在血 液中表达水平的变化能够直接或间接反映病理状况的改变，也是导致具有相同组织病理 类型和分期的肿瘤患者表现不同预后，或不同治疗反应原因之一。本实验拟将噬菌体展 示技术与蛋白质芯片技术相结合，利用筛大量已存的 NSCLC 患者血清及随访结果选出 新型 NSCLC 高敏感性和特异性的血清自身免疫抗体作为分子标志物用于 NSCLC 的预 后评价。 方法：1. 提取 5 份非小细胞肺癌（Non Small Cell Lung Cancer，NSCLC）术后肿瘤 组织总 RNA，纯化 mRNA 并构建 T7 噬菌体 cDNA 文库。2. 利用 NSCLC 预后良好和 不良患者血清对 T7 文库进行生物淘洗，挑选出 1268 个肿瘤特异性的 T7 单克隆构建蛋 白芯片。3. 构建蛋白芯片，并分别用 23 分预后良好患者血清和 34 分预后不良血清孵育 芯片并进行 Cy5/Cy3 双荧光标记。4. 分析扫描芯片所得数据，筛选出能够区分预后良 好和不良血清的诊断标志物组合并进行留一法验证其准确性。5. 对肿瘤特异性的 T7 插 入序列进行 PCR 测序，Blast 所得 DNA 序列并进行分析。 结果：1.成功构建非小细胞 T7 噬菌体 cDNA 文库，滴度检测表明原始文库滴度为 3.7×106pfu/mL。随机挑取 96 个噬菌斑进行 PCR 检测，结果表明文库的重组率为 95%， 符合质量要求。2. 文库经扩增，滴度检测为 7×1010 pfu/mL。随机挑取 96 个噬菌斑进行 PCR 检测，结果表明文库重组率为 95%，97.9%克隆（插入片段）大于 250bp，10.5%克 隆大于 750bp。生物淘洗后随机挑选 96 个克隆进行 PCR，结果表明淘洗后文库重组率 为 98%，92.9%克隆大于 250bp，18.4%克隆大于 750bp。淘洗后重组率明显提高，并且 I 含有大片段的克隆得到明显富集。3. 构建的蛋白芯片经 Cy5、Cy3 双荧光检测系统及统 计学筛选分析芯片后，得到最佳评价组合含 6 个 NSCLC 预后相关标志物，其联合诊断 准确率达到 80.7%，敏感性为 85.3%，特异性为 73.9%，AUC 为 0.825。测序及 Blast 分 析表明其中 3 个标志物是已知癌细胞转移和预后相关分子，分别是 abl-interactor 1 (ABI1)，pleiotrophin (PTN)和 surfactant protein B (SFTPB)。另外 3 个标志物都是人基因 组中未研究过的基因。 结论：成功构建非小细胞肺癌 T7 cDNA 文库，经淘洗和生物芯片筛选得到一个含 有 6 个标志物的预后评价组合能够对肺癌预后进行较准确的诊断，丰富了非小细胞肺癌 预后不良标志物的种类，提供了一种利用血清来达到非小细胞肺癌预后评价的一种方法 并为癌症的治疗奠定了一定基础。 关键词 非小细胞肺癌；预后；蛋白芯片；自身免疫抗体 II Abstract Abstract Abstract Background Lung cancer is the leading cause of cancer death world wide, its morbidity and mortality remain the first in all kinds of tumors. Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for 80% of lung cancer cases. The main reason of the high mortality is due to the lack of accurate means of early diagnosis and effective monitoring method for therapeutic effects. Because there ar