生物化学实验-糖酵解中间物的鉴定.pptVIP

糖酵解中间产物的鉴定 2006.11 一、目的 通过回顾糖酵解和三羧酸循环的代谢过程，明确本实验鉴定的代谢的中间产物所处的代谢阶段及相关的酶，了解实验设计的思路。 加深对糖酵解过程的感性认识。 二、原理 在代谢正常进行时，中间产物的浓度往往很低，不易分析鉴定。若加入某种酶的专一性抑制剂，则可使其中间产物积累，便于分析鉴定。 3-磷酸甘油醛是糖酵解的中间产物，利用碘乙酸对3-磷酸甘油醛脱氢酶的抑制作用，可使3-磷酸甘油醛不再转化而积累，同时加入硫酸肼作稳定剂，积累的3-磷酸甘油醛就不会自发分解。 用羰基试剂2,4-二硝基苯肼与其在偏碱性条件下反应，生成3-磷酸甘油醛-2,4-二硝基苯腙，再加过量的氢氧化钠即形成棕色复合物，其棕色深度与3-磷酸甘油醛含量成正比。 本实验涉及的知识点有： 糖酵解 三羧酸循环 酶的专一性抑制、非专一性抑制、不可逆抑制 糖酵解 概念 生物学意义 反应历程 把葡萄糖降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是一切生物有机体中普遍存在的葡萄糖降解途径（EMP）。 产生能量——净产生2分子ATP;产生一些代谢中间产物，为生物合成提供原料。 三个阶段十步反应。 己糖磷酸化 磷酸己糖的裂解 3－磷酸甘油醛生成丙酮酸 丙酮酸的去路： 涉及的反应： 几种主要试剂的作用： 硫酸肼 ——？ 碘乙酸 ——？ 三氯乙酸——？ 稳定剂 3－磷酸甘油醛脱氢酶的抑制剂 蛋白质、酶的变性剂 三、操作步骤 1．加试验材料和试剂 取3支10mL离心管，编号，分别称取并加入干酵母0.1g，再按下表加试剂，加完试剂后，每管中插入一支玻璃棒，搅匀，玻璃棒留在管中。 2. 保温和观察气泡 将上述三支离心管（连同玻璃棒）置于37℃水浴中的试管架上保温10min。观察各管生成气泡的量有无不同，为什么？ 3.补加试剂 5．显色和观察结果 取3支15mL试管，编号，分别加入上述相应的上清液0.5mL，并按下表加入试剂和处理，每加完一种试剂，各管均要摇匀。最后，观察各管颜色深浅有无差异，哪管最深？哪管最浅？为什么？ 注意事项： 1．本实验虽为定性鉴定，但在称重和量取体积时仍要求相对准确。 2．应随实验材料来源不同，摸索适宜的保温时间。 四、结果分析 描述观察到的实验现象并对实验结果加以分析。包括保温后气泡量及最后的显色结果。 * * 己糖激酶 葡萄糖 6－磷酸葡萄糖 6－磷酸果糖 1，6－二磷酸果糖 磷酸己糖异构酶 磷酸果糖激酶 ATP ATP 1.己糖磷酸化 2.磷酸己糖裂解 3.ATP和丙酮酸的生成 1，6－二磷酸果糖 磷酸二羟丙酮 ＋ 3－磷酸甘油醛 醛缩酶 3－磷酸甘油醛 1，3－二磷酸甘油 三磷酸甘油醛脱氢酶 丙酮酸 有氧条件： CO2 + H2O 三羧酸循环、电子传递链 无氧条件： 生成乙酰CosA 生成乳酸 生成乙醇 苯腙 3－磷酸甘油醛脱氢酶活性中心有半胱氨酸，为巯基酶。碘乙酸可与之发生反应，为不可逆抑制。 0 0.5 0.5 0.56mol/L硫酸肼(mL) 0 0.5 0.5 0.002mol/L碘乙酸(mL) 0 0 1 5%三氯乙酸（mL） 5 5 5 5%葡萄糖（mL） Ⅲ Ⅱ Ⅰ 管 号 试剂 0.5 0 0.56mol/L硫酸肼(mL) 0.5 0 0.002mol/L碘乙酸(mL) 1 1 5%三氯乙酸(mL) Ⅲ Ⅱ 管 号 试 剂 加完试剂后，用管中玻棒搅匀，取出玻棒，静置3 min。 4．离心 将上述三支离心管中的反应液分别离心（离心前先平衡），然后留上清液备用。3000rpm 3min. 观察颜色深浅 3.5 3.5 3.5 0.75mol/L氢氧化钠（mL） 室 温 放 置 1min 0.5 0.5 0.5 2,4-二硝基苯肼（mL） 室 温 放 置 1 min 0.5 0.5 0.5 0.75mol/L氢氧化钠（mL） 0.5 0.5 0.5 上清液（或滤液）（mL） 3 2 1 管 号 试 剂 五、讨论 1．实验鉴定的是哪种中间产物？ 2．实验中三氯乙酸（强酸一种蛋白质变性剂）、碘乙酸、硫酸肼三种试剂分别起什么作用？ 3．实验中的气泡是什么气体？如何产生的？ *