课件：DNA连接与转化.pptVIP

二、实验试剂 ＬＢ培养基 质粒ＤＮＡ（含Amp抗生基因），受体菌 CaCl2 0.1M Amp 三．实验方法 一、感受态细胞制备 １．将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，３７℃培养１６～２０小时。 ２．挑取单菌落转入２０ｍｌ ＬＢ培养基锥瓶中，３７℃振荡过夜。 ３．从中取２ｍｌ菌液转入５０ｍｌ ＬＢ培养基中３７℃振荡培养４－５小时， 测ＯＤ１００达０．４～０．５。 ４．培养物于冰上１０分钟。 ５．转入－５０ｍｌ离心管，于４０００ｒｐｍ下４℃离心１０分钟。 ６．弃上清，倒置离心管１分钟，流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上１０分钟。 ７．4,000rpm 4℃离心１０分钟，弃上清。 ８．加入2ml，0.1M CaCl2悬浮细胞，于４℃过夜。 二、转化 １．在1.5ml Eppendorf管中加入２００μl感受态细胞和１０μl 40ng DNA溶液， 温和混匀，于冰上３０分钟。 ２．于４２℃水浴９０秒。 ３．冰浴２分钟。 ４．加入８００μl ＬＢ 液体培养基３７℃ ４５分钟。 ５．取２００μl涂布于含Amp(50μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。 四．结果与分析讨论 １．计算转化率。 ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 问题与讨论： １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪些？ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？ 实验十二 DNA的连接与转化  1.ＤＮＡ分子的体外连接 2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选 . 一．实验目的及背景 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。 1、ＤＮＡ分子的体外连接 ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。 连接反应中值得注意的几个问题： 1.ＤＮＡ连接酶 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 二者的作用机理类似。 Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制 Ｔ４连接酶作用分三步： １．Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形成酶－ＡＭＰ复合物。 ２． 酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。 ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来. 2.连接反应的温度 ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。 3. DNA的平未端和粘性末端 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的， 4.碱性磷酸酶处理质粒载体 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。见下图。 5.连接反应的检测 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。 我们下面的实验从粘性末端为例操作。 二、实验试剂 １．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer 200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫苄糖醇 500μl/ml BSA ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 ４．5mM ATP 三．实验方法 ＤＮＡ分子的体外连接 １．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液： a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。 b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。 c. 加入： １０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer 1μl Ｔ４ＤＮＡ连接酶 0.1Weiss 5mM ATP 1μl ２．盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。 ３．１２℃下过夜连接反应。 ４．反应结束后于－２０℃保存。 四．结果与分析 电泳检查连接结果 １．如何判断连接效果的成功性？ 问题与讨论： １．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ２．简述一个