氟西汀对星形胶质细胞活性影响及脂多糖诱导分泌细胞因子TNF α、IL 6的影响及其机制-精神病与精神卫生学专业论文.docx

汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 中文摘要 背景和目的 近年来随着对抑郁症研究的不断深入，其发病机制已经不再仅局限于单纯的神经递质 失调学说。抑郁症患者在服用抗抑郁药物之后，不但神经突触间隙间 5-羟色胺（5- serotonin,5-HT）、多巴胺(dopamine，DA）及去甲肾上腺素（noradrenalin，NA）浓度 会升高，而且病人体内的炎症前细胞因子（Proinflammatory cytokines）水平也会较发 病期间明显降低。国内外大量的体内及体外研究发现炎症前细胞因子，诸如 IL-1β、IL-6、 NO 及 TNF-α等能够通过影响神经胶质细胞的活化及神经发生、海马区神经元的损伤及再 生修复及神经营养性类因子，如脑源性神经营养因子（ Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等的生成直接或者间接的导致抑郁症的发生。神经胶质细胞是中枢神经 系统中脑细胞的重要组成部分，它们不但起到支持、营养神经元的功能，而且能够分泌上 述的多种炎症前细胞因子，这些细胞因子分布及作用广泛，并通过特殊的途径与神、免疫、 内分泌系统相互作用组成神经-免疫-内分泌系统，在应对应激、炎症反应等过程中起到重 要作用，而应激及炎症反应过程可能参与到抑郁症的发病机制中。因此一些学者认为炎症 前细胞因子在抑郁症的发病机制中起到了重要作用。 大量的文献表明：抑郁症患者体内的细胞因子如 IL-1、IL-6、NO 及 TNF-α水平比正 常人明显升高，这些细胞因子对抑郁症症状如抑郁心境、快感缺失、疲劳及睡眠障碍的发 生发展起到促进作用。经抗抑郁药物治疗后，细胞因子水平较前明显降低。通过腹腔注射 脂多糖(LPS)或者经过 21 天慢性不可预测性应激均可导致大鼠的行为性抑郁以及大鼠脑内 细胞因子含量增加。细胞因子在脑内可作用于海马区域抑制其神经发生，而海马区神经发 生减少也参与了抑郁症的发病机制。注射抗抑郁药物后可对抗这种作用。在细胞水平，大 鼠脑胶质细胞系体外培养经过 LPS 或者 IFN-γ等刺激后其分泌细胞因子水平明显升高，给 予抗抑郁药物可以明显抑制胶质细胞系的活化增殖，而且减少了细胞因子分泌。 本实验通过观察氟西汀对大鼠星形胶质细胞活性的影响及其对脂多糖刺激的星形胶 质细胞对 IL-6 及 TNF-α分泌作用的影响，来验证抗抑郁药对大鼠胶质细胞系细胞因子分 泌存在抑制作用，从侧面验证细胞因子在抑郁症中的作用并探讨药物作用机制。 I PAGE PAGE IV PAGE PAGE III 材料和方法 1、 实验设计 1.1 氟西汀对星形胶质细胞活性的影响 星形胶质细胞按照一定细胞浓度接种到 96 孔板中，利用（0,1,5,10,20,40,60） μΜ氟西汀孵育细胞 24h、48h、72h。利用 MTT 法观察各浓度、时间细胞活性的变 化。 1.2 氟西汀对 LPS 诱导的星形胶质细胞分泌细胞因子的影响 将一定细胞浓度的星形胶质细胞接种到 48 孔板，分为对照组、LPS 组及氟西汀 组，氟西汀组经过（5,10,20,40）μΜ氟西汀预处理 24h 后，氟西汀组和 LPS 组同 时经 1μ/g/ml 的 LPS 刺激 24h，对照组加入同体积稀释液。24h 后收集上清液，用 Elisa 法测上清液中细胞因子含量。 1.3 星形胶质细胞分泌 IL-6 的通路机制研究 将一定细胞浓度的星形胶质细胞接种到 48 孔板，分为对照组、LPS 组、PDTC 组， 氟西汀+PDTC 组。PDTC 组经过（50,100,150,200）μΜ PDTC 预处理 24h 后氟西汀+PDTC 组经过相应浓度的氟西汀和 PDTC 预处理 24h，PDTC 组、氟西汀+PDTC 组和 LPS 组同 时经 1μ/g/ml 的 LPS 刺激 24h，对照组加入同体积稀释液。24h 后收集上清液，用 Elisa 法测上清液中细胞因子含量。 2、 星形胶质细胞的培养、纯化和鉴定 2.1 原代星形胶质细胞的培养 取 24-48h 内新生 SD 鼠 4 只，酒精消毒后断头取脑，打开颅骨，剥离脑膜，去掉嗅球， 分离大脑皮层，放入 2ml DMEM/F12 培养基中，用无菌吸管机械吹打约 200 次，制备神经 胶质细胞混悬液。经 200 目钢网过滤至无菌培养皿中以去除组织碎块，将过滤后的神经胶 质细胞混悬液转移至无菌细胞培养箱 30min 去除成纤维细胞，再将去除纤维细胞的神经胶 质细胞混悬液转移至无菌细胞培养瓶，加入含 10% FBS 的 DMEM/F12，放入细胞培养箱 培养，24h 后首次换液，此后每隔 2-3d 换液，培养约 21d，星形胶质细胞和小