副溶血性弧菌噬菌体SHOU24的分离及特性的初步研究-食品科学与工程专业论文.docx

上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学 硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 答辩地点 答辩日期 副溶血性弧菌噬菌体 SHOU24 的分离及特性的初步研究 摘 要 微生物致病菌引起的各种食源性疾病对人类健康产生严重危害，尤其是致病 菌耐药性问题的出现使常规治疗陷入了困境。噬菌体是一类感染细菌的病毒，在 自然界中广泛存在，具有严格的宿主特异性。比于传统的抗生素疗法,噬菌体具备 特异性强、增殖能力强、自然界中广泛存在、对人体肠道无害、安全性高、对耐 药菌株的再侵染性等特点。噬菌体分解后的产物为氨基酸和核酸残片，对人体和 动物无害，也不会对环境或食品基质的固有微生物菌群产生破坏作用。当人们摄 入含有噬菌体处理的食品时，可以视为自源性。适当条件下，噬菌体是以指数方 式进行增殖，能有效增强抗菌的效果。随着超级细菌的出现和消费者对食品安全 的重视，采用细菌的天敌——噬菌体及其所编码的裂解酶来控制食源性致病菌， 为食源性致病菌的检查及生物防治开辟了一条新的途径。 副溶血性弧菌为革兰氏阴性菌，是一种重要的食源性致病菌。副溶血性弧菌 容易污染各种海产品如虾、贝类、蟹和盐腌食品，夏秋季在港湾及沿海地区的检 出量很高。但并不是所有的副溶血性弧菌都有致病性，含有耐热直接溶血素 （thermostable direct hemolysin, TDH）和（或）耐热直接溶血素相关溶血素（TDH- related hemolysin， TRH）的副溶血性弧菌才有致病性。 为了探寻利用烈性噬菌体来有效控制水产品中致病性副溶血性弧菌，本研究 分离得到一株对含致病性 tdh 基因有作用的副溶血性弧菌噬菌体 SHOU24，测定 了噬菌体 SHOU24 的相关生理特性，采用全基因组测序和生物信息学方法分析该 噬菌体的基因信息，并且对 SHOU24 作为抑菌剂应用于食品中作了初步探究。以 上结果为副溶血性弧菌噬菌体 SHOU24 作为抑菌剂应用于食品中提供了理论基 础。本研究主要研究内容和研究结果如下： 1. 致病性副溶血性弧菌噬菌体 SHOU24 的分离 从水产品市场的污水、东海取样，样品前处理后，采用 0.22μm 滤膜过滤。 取上清液与 32 株含 tdh 基因的副溶血性弧菌和 85 株非致病的副溶血性弧菌共孵 育，采用双层平板法 37℃恒温培养来分离对副溶血性弧菌有感染作用的烈性噬菌 体。培养 6~10h，挑取单个噬菌斑，三次纯化后得到一株对含 tdh 致病基因有感 染作用的裂解性噬菌体，命名为 SHOU24。采用 60%的甘油保存高效价的噬菌体 SHOU24 于-80℃条件下。 I 2. 噬菌体 SHOU24 生理特性的测定、全基因组测序和生物信息学分析 采用负染方法，电镜观察噬菌体 SHOU24 为长尾噬菌体科。头部直径约为 70nm，电镜观察呈六边形，尾部直径约为 200nm，并且有尾丝结构。噬菌体的核 酸分为双链 DNA，双链 RNA，单链 DNA 和单链 RNA,长尾噬菌体的核酸基本为 双链 DNA，故推测噬菌体 SHOU24 的核酸为双链 DNA。采用点滴法和双层平板 法相结合的方法，测定噬菌体 SHOU24 的宿主谱，实验结果表明该噬菌体只能感 染含 tdh 致病基因的副溶血性弧菌，且宿主菌都为实验室分离得到的菌株，对 ATCC 菌株和大流型菌株 O3：K6 并没有作用。测定效价为 7.2×1010pfu/m 的噬菌 体 SHOU24 在不同温度和不同 pH 的条件下的稳定性。培养宿主菌至对数期（OD600 值约为 0.6），以 MOI =0.01 比例测定噬菌体 SHOU24 在 37℃下的一步生长曲线。 一步生长曲线的实验结果进一步表明该噬菌体为烈性噬菌体。采用液态法扩增噬 菌体 SHOU24，NaCl-PEG6000 的方法纯化并浓缩噬菌体，为了满足基因测序的 要求，采用 CsCl 不连续密度梯度离心获得 1011-1012 效价的高纯噬菌体，利用试 剂盒抽提噬菌体的核酸，Nanodrop 分光光度计测定核酸浓度，符合测序要求 （200ng/μL）的核酸送去南方基因中心测序。基因测序结果表明噬菌体 SHOU24 的核酸大小为 77,837bp,G+C 含量为 46.0%，采用 Glimmer 和 Gene Mark 分析该 噬菌体有 96 个阅读框（ORFs），其中 88 个阅读框在 NCBI 蛋白数据库中有同源 性。许多核心基因的同源性和其他无相关的细菌或病毒的同源性较高。噬菌体裂 解酶以及和裂解相关的酶并没有注释出来，软件 PHACTS 分析该噬菌体为烈性噬 菌体。噬菌体的基因为典型的模块基因，基因注释结果表明，噬菌体 SHOU24 含 有和 DNA 复