副溶血性弧菌Chn25菌株质粒和可移动元件消除及其对全基因组基因转录影响的研究-食品工程专业论文.docx

上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 李晓虹 上海出入境检验检疫局 研究员 主席 陶妍 上海海洋大学 教授 委员 张东来 上海市农业科学院农产 品质量标准与检测技术 研究所 副教授 委员 欧杰 上海海洋大学 副教授 委员 杨静 上海海洋大学 博士 秘书 答辩地点 上海海洋大学食品学 院 A209 会议室 答辩日期 2015.06.05 副溶血性弧菌 Chn25 菌株质粒和可移动元件消除及其对 全基因组基因转录影响的研究 摘要 副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，也是重 要的水产品食源性致病菌，广泛存在于海水、海产品及盐渍食品中。副溶血性弧 菌污染引发的食品安全事件已位居我国微生物性食物中毒事件的首位，也已成为 一个严重的食源性公共卫生问题。 本研究探索了添加化学消除剂十二烷基磺酸钠（Sodium Dodecyl Sulfonate， SDS）和提高生长温度结合法消除副溶血性弧菌 Chn25 质粒的最佳诱变条件，试 验结果表明，在胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic Soy Broth，TSB)培养基中添加终浓度 为 0.2%的 SDS 和 42℃高温亚致死条件下处理，获得目的菌株质粒消除率高达 60% 以上。在研究中我们首次发现此物理化学相结合法，对于副溶血性弧菌 Chn25 染 色体上 SXT/R391 家族整合性接合元件（integrative and conjugative element， ICEVpaChn1）也具有高效的消除作用，筛选获得了 ICE 元件和/或质粒消除突变 菌株，其典型抗生素耐药性消除率为 100%。突变型与野生型菌株的形态学观察 发现，细菌的外部形态以及鞭毛等主要附属结构不受上述消除条件的影响，此方 法是一种对于细菌相对安全的消除法。表型分析发现，已消除 ICE 元件的突变株 并不参与调控其重金属耐受性和运动性；并且移动元件的消除是可逆性的，此方 法未损害原有基因插入位点，适宜培养条件下菌株具有重获 ICE 的能力。本研究 获得的质粒和 ICE 元件消除菌株已应用于本实验室基因敲除的研究。 运用 Solexa 双端高通量转录组测序技术分析基因缺失对野生型和三株突变型 菌株转录组的影响， 利用 GO(Gene Ontology)、 COG(Clusters of Orthologous Group)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库初步分析转录水 平差异基因的功能，结果显示：与野生型相比，ICE 全消除突变株（K）、ICE 与 质粒 A 共消除突变株（PA）、ICE 与质粒 AC 共消除突变株（PAC），差异表达基 因数目依次呈现出明显的递减趋势，上调基因逐渐成为优势基因，最终上下调基 因基本平衡。突变株 K 与野生型相比，11.4%基因表达显著上调，参与的代谢途 径为碳水化合物代谢、能量代谢、氨基酸代谢、信号传递系统；16.3%基因表达 显著下调，参与代谢途径为脂肪代谢、膜转运系统、肽聚糖的合成、辅助因子与 维生素、核酸复制修复核苷酸的代谢、外源物质降解与代谢、翻译功能。突变株 PA 与野生型相比，11.3%基因表达显著上调，参与代谢途径为碳水化合物代谢、 能量代谢、氨基酸代谢、脂肪代谢、信号传递系统、膜转运系统、肽聚糖的合成、 辅助因子与维生素代谢、外源物质降解与代谢；5%基因表达显著下调，参与代谢 途径为核酸复制修复、核苷酸的代谢、翻译功能。突变株 PAC 与野生型相比，6.5% 基因表达显著上调，参与代谢途径为能量代谢、脂肪代谢、信号传递系统、膜转 运系统、辅助因子与维生、外源物质降解与代谢、翻译功能；6.6%基因表达显著 下调，参与代谢途径为碳水化合物代谢、氨基酸代谢、核酸复制修复、核苷酸的 代谢。野生型和突变型菌株的转录组比较分析，揭示了质粒和 ICE 缺失对副溶血 性弧菌 Chn25 全局性基因转录的影响。本研究结果为质粒的遗传演变以及整合性 接合元件维持与丢失机制的深入探讨奠定了一定的理论基础。 关键词：副溶血性弧菌、质粒、整合性接合元件、消除、转录组 Impact of the deletion of plasmids and mobile genetic elements on the global-level gene transcription of Vibrio parahemolyticus Chn25 ABSTRACT Vibrio parahaemolyticus is a gram-negative halophilic bacterium and often ex