副猪嗜血杆菌多基因位点分子分型研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

摘要 摘要 11111111111111111111111111111111111111111111111111 摘要 Y1850289 副猪嗜血杆两 (lliαemophilus pαrαsuis，Hps)是猪格拉瑟氏病的病原酶，引起猪多 发性浆膜炎的败血症成以多发性浆腺炎，心包炎，关节炎以及脑膜炎二用传统免疫哼 学方法巳证明刷猪嗜血料:菌有 15 个血清型且各血清型之间无交叉保护作用。然而， 用传统的血清型分型方法每年有高达 1520%的野生株不能分型。为了克服这些不 足，发展了基于 DNA 指纹阁谱的基因分型(限制性内切酶阁谱，月结忏菌基因归 j 保 守重复序列 E阳C-PCR) 等研究，然而，这些分型技术都是基于不问条带大小的比 对，产生的数据很难共卒，无法企阳性比较，菌群之间的相互关系信息也很少，问 时现阶段我国目前尚无用于血滑到和血清学研究的特异性血清和抗 b;[ ?因此， 用 DNA 测序的方法研究多基因位点分型，对于了解副猪嗜血杆菌的群体卢 ;ij构和遗传关 东，揭示菌株的基因型与毒力之间的相关性，为革拉瑟氏病免疫预阳先走基础有着 重要的意义。 我们采用分子生物学方法分别对刷猪嗜血杆菌 86 个分离株的 7 个持家基因，包 指 ATP 合成酶。馄(α伊D)、翻译起始因子IF-2 (的加)、核糖体蛋白白亚基(叩oB)、苹 果酸脱氮酶 (mdh)、 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 (6pglφ、3-磷酸甘油田基脱氢酶 (g3pd)和延 胡索酸还原酶 B(斤。)进行了 PCR 扩增;对扩增产物进行了测 ff: 分析了序列类型 。丁);构建了邻联(NJ) 树和系统进化(UPGMA)树，分析了菌株之间的进化关系。 主要结果如下: 1 7 对引物用于副猪嗜血杆菌 7个持家墨因的扩增:在同一优化的 PCR 反应 条件下，每个两株都扩增出 7个大小为 450-600bp 的条带。 2 对 46 个菌株的 7个基因位点的序列进行测序，用软件对序列编辑、队列比 对、建立 MLST 定义、等位基因序列文件等，井和 PUBMET 公布的 40 株商株 7个 基因位点的序列一起，与牛津大学动物系 Keith Jolley 合作建立了副猪嗜血杆菌 86 个分离株的 MLST 数据库，建立在国陈互连网上的这些分离株的等位基因图谱戒序 列型，构成了可以不断扩展的真实分离株资料。这些资料为进一步构建副猪嗜血杆 菌分离株流行病学的全球完整剧谱和更详细的研究该做生物的群体遗传学提供了重 要基础。 3. 经 START2 分析发现所研究的分离株有高度的遗传异源性， 86 个商株被分 成 74 个序列类型。基因平均距离为 0.674，IA=0.804o 每个基因位点存在 64-76 不 等数目的等位基因。基因序列多态性位点最大 (fedB)达 325 和 (6pgd)219，最小 ( intB)为 77。 4. 用 UPGMA 分析确定了 5 个菌群。 5. 发现同一猪场或同一头猪可分离到不同(达到 10 个)的副猪嗜血忏酶，发 11 III I I I 病猪和未发俯猪上呼吸道均存在毒力商株。 关键词:高IJ 猪嗜血杆囱;持家基因;等位基因;序列分型 Abstract Abstract IV IV Abstract Hαrmophilus par αsuis is the etiological agent of Glassers disease in pigs，which is characterized by serofibrinous to fibrinopurulent polyserositis ，arthrites，and meningitis. 15 serovars of Hparasuis strains have been defined by traditional immunological meoths (based on heat-stable somatic antigen and using immunodiffusion).ηle corss-protection between different serotypes is variable or not prensent. However，15-20% of the stains remained non-typeable. To overcome those limitations，several genotyping methods based on DNA fingerpring (Restriction endonuclease pattem and ERICPCR) have been develop