单细胞蛋白质组学新方法研究-生物信息技术专业论文.docx

万方数据 万方数据 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密□， 在 年解密后适用本授权书。 本论文属于  不保密□。 （请在以上方框内打“√”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 摘 要 后基因组时代，以核酸、蛋白质、代谢物以及它们之间相互作用网络为对象的 各种“组学”研究，已经成为发现生命的化学基础和加速人们对其分子机制更加深 入了解的主要工具。尤其是最年来，癌症和干细胞等领域的重大突破揭示了群体细 胞中某些细胞在功能上表现出的异质性，对“组学”研究向单细胞水平延伸提出了 明确的需求，催生了多种单细胞分析方法产生和快速发展，例如，微流控芯片、流 式细胞术、质谱、拉曼光谱等高灵敏度、高通量和高分辨率的分析手段，为单细胞 基因组、单细胞蛋白质组和单细胞代谢组等单细胞组学研究提供了强大的研究手段。 流式细胞术和化学细胞术是单细胞蛋白质组研究的两大核心技术。基于最近发展 起来的基于活性的荧光探针（ABP, Activity-Based Probe）技术，本文提出一种新的 单细胞蛋白质组学（Single-cell proteomics）分析方法，将流式细胞术功能性标记理 念与化学细胞术的单细胞全局蛋白质组分析理念相结合，从功能入手，建立了单细 胞功能蛋白质组研究新策略。基于该策略，我们构建了达到单细胞检测水平的毛细 管电泳-激光诱导荧光系统，并结合 ABP 探针的特异性和荧光报告特性，对细胞表面 低丰度的膜受体蛋白家族（GABAB 受体）和细胞器内的难以标记的蛋白酶（半胱氨 酸组织蛋白酶）进行单细胞蛋白质组分析。主要工作内容如下： （1）发展了高分辨率、高灵敏度、适用于单细胞分析的毛细管电泳-激光诱导荧 光装置。构建了单细胞进样装置，能够精准地将单个目标细胞导入毛细管中，并验 证了系统的可靠性；利用聚丙烯酰胺等对毛细管内壁进行了共价修饰，以防止蛋白 质吸附并提高分离效率，对分子量标记蛋白质进行分离表明，其分辨率达到了文献 报道的最好水平；采用荧光素样品，证实了本系统的检测限为 4×10-12M；对毛细管 区带电泳和毛细管筛分电泳两种电泳模式，我们都获得了较高的重现性。 （2）基于上述平台，我们发展了一种基于 ABP 的单细胞蛋白质组学新方法， 并详细研究了细胞膜表面低丰度 GABAB 家族功能性蛋白质组表达。ABP 探针在分 子结构上由串联的 3 个功能域(ABC)构成：A 域为向导区，通过识别靶蛋白质与其形 I II万方数据 II 万方数据 成非共价结合；B 域为锚定区，通过点击化学将该分子共价结合在靶蛋白质上；C 域为指示区，为高灵敏的荧光分子结构。通过 ABP 探针，可以高选择性地实现单细 胞上指定的蛋白质群的功能化标记；标记的细胞再通过单细胞毛细管电泳获得单细 胞功能性蛋白质组表达谱。为验证该方法的可靠性，我们首先获得了单个 HEK 细胞 的 GABAB1(GB1)-like 蛋白质组表达谱，通过对比过量表达 GB1 的 HEK 细胞蛋白质 表达谱和蛋白质分子量谱，确认了 GB1 在图谱中的位置；在单细胞水平，对比了 GB1 在 HEK、MEF 和 CHO 等不同细胞系之间以及同一 MEF 细胞系内不同细胞之间的表 达结果，发现不同细胞系之间或同一细胞系不同细胞之间差异明显；将上述方法应 用于小鼠原代颗粒神经元细胞(CGN)的 GB1 表达分析，发现同源细胞群体内部的细 胞异质性，进一步的 GB1 拮抗剂和激活剂的药物竞争性实验证实了结果的可靠性。 （3）对于细胞胞质、甚至细胞器内的各种酶类而言，细胞膜成为了阻碍活性探 针进入细胞并标记它们的第一道屏障。我们针对半胱氨酸组织蛋白酶的，设计能够 透过细胞膜的 ABP 探针，用活细胞实时荧光成像的方法确定了探针孵育、恢复时间 等细胞标记的关键参数。基于该 ABP 探针和单细胞功能蛋白质组分析新策略，我们 研究了单个细胞水平半胱氨酸组织蛋白酶的表达谱。并对比了群体细胞水