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副溶血弧菌T3SS2新效应蛋白的鉴定及其功能的初步研究-生物学专业论文
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浙江理工大
浙江理工大学硕士学位论文
副溶血弧菌 T3SS2 新效应蛋白的鉴定及其功能的初步研究
中文摘要
副溶血弧菌是一种全球性传播的病原菌,感染时能引发急性肠胃炎、伤口感 染,甚至诱发败血症。研究显示该菌毒力因子包括溶血毒素、粘附素、Ⅲ型及Ⅵ 型分泌系统等,其中Ⅲ型分泌系统及其分泌的效应蛋白与其致病性密切相关。由 染色体 1 编码的Ⅲ型分泌系统T3SS1 分泌的效应蛋白主要通过诱导细胞自噬、变 圆和裂解这一系列过程来发挥细胞毒性作用;染色体 2 编码的Ⅲ型分泌系统 T3SS2 分泌的效应蛋白主要通过破坏细胞骨架和操控细胞信号传导等发挥肠毒 性作用。目前针对Ⅲ型分泌系统T3SS2 的研究引起国内外学者的广泛关注,由于 T3SS2 有 80 个相关基因编码在VP-PAI毒力岛上,其中仅少数几个蛋白得到研究, 因此本实验从中选出几个新型的效应蛋白进行研究。
首先利用生物信息学技术从T3SS2 相关VP-PAI上筛选出VPA1324 和VPA1360 两种基因,通过构建两种基因的重组表达载体,诱导表达并纯化蛋白,然后免疫 小鼠获得相应抗血清。通过Western blot和RT-PCR两种方法验证在胆盐作用下 VPA1324 和VPA1360 基因转录表达情况,结果显示VPA1324 和VPA1360 蛋白是 T3SS2 相关的分泌蛋白。其中VPA1324 经生物信息学分析可能为二鸟苷酸磷酸 二酯酶。为此,以c-di-GMP为底物,利用高效液相色谱法检测VPA1324 蛋白酶 活性,结果表明VPA1324 可降解c-di-GMP,具有磷酸二酯酶活性。构建该基因 的重组质粒pEGFP-VPA1324-C1 并转染至Hela和Caco-2 细胞中,发现VPA1324 的 表达导致细胞出现皱缩,通过Annexin V-FITC/PI双染色和Hoechst 33342 染色分 析,表明VPA1324 可导致细胞发生凋亡。
综上所述,VPA1324 和VPA1360 蛋白是T3SS2 分泌的效应蛋白,VPA1324 为一种磷酸二酯酶,能促使细胞凋亡。新效应蛋白的研究不仅有助于我们深入理 解病原菌的毒力及感染作用机制,同时为真核生物本身的作用机制提供了独特的 视角。 关键词:副溶血弧菌;毒力因子;效应蛋白;T3SS2;VPA1324;细胞凋亡
I
ABSTRACT
Vibrio parahaemolyticus is a bacterial pathogen that causes disease throughout the world, virulent strains can cause acute gastroenteritis, wound infections, even induce septicemia. It’s main pathogenicity is associated with a wide variety of virulence factors, including hemolytic toxin, adhesin, type III secretion system, type VI secretion system, etc. The related effectors of type III secretion system are closely related to the pathogenicity of the bacteria. One of the type III secretion system T3SS1 is encoded in the chromosome one can secrete effectors mainly to exert cytotoxicity by inducing autophagy, cell rounding and pyrolysis, the other, type III secretion system T3SS2 is encoded in the chromosome two can secrete effectors mainly through the de
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