实验五肝细胞中核酸的离和测定.pptVIP

一、目的与要求 1、学习从动物肝细胞中提取和分离核酸的原理 2、掌握利用紫外/可见光分光光度计测定核酸的方法 三、试剂与器材 1、试剂 1）细胞提取液 2）0.1mol/LTris-HCl缓冲液（PH7.4) 3）蔗糖-氯化钙盐溶液等（见指导书） 2、材料：新鲜猪肝 3、器材：离心机、水浴锅、解剖剪与镊子等 * * 二、原理 1、 依据离心原理，从肝细胞中提取出细胞核沉淀溶于蔗糖-氯化钙盐溶液中抽提，得核酸粗制品。再用三氯乙酸及有机溶剂抽提，除去小分子物质和脂类，最后用0.3mol/L高氯酸提取，获得较纯的核酸物质，可进行测定。 为防止核酸大分子的变性降解，在提纯过程中必需在0~4℃的条件下操作。 2、利用脱氧核糖颜色反应特性，通过分光光度计比色法计算DNA含量。 4、主要的仪器 1）研钵 2）玻璃匀浆器 3）离心机 4）分光光度计 5）酸碱度计 6) 台秤 7）水浴锅 操作流程 1．细胞破碎 2．收集核沉淀 3．核酸的分离 4．DNA的定量测定 1）标准曲线 2）核中DNA含量的测定 5. 计算 　单位：每g肝鲜重含DNA mg 1、细胞破碎 1）称取5克新鲜猪肝—绞碎肝—用冰细胞提 取液少许洗涤2次—加2ml冰细胞提取液匀浆 —做一组织涂片镜检，观察细胞是否破碎 2、收集细胞核沉淀 1）在肝糜中添加6ml冰细胞提取液制成肝匀浆液 2）离心： （1）离心：离心管盛8ml肝匀浆液，配平。 离心10 min,700r/min （2）离心：弃去上清液，将沉淀悬于8ml 冰0.1mol/LTris-HCl缓冲液中，配平。 离心10 min,700r/min。获细胞核沉淀 3、核酸的分离 （1）离心3：核沉淀加入2ml冰蔗糖-氯化钙盐溶液，制备悬液，配平。 离心10 min,（1500r/min） （2）离心4：弃去上清液，核沉淀加5ml冰 三氯乙酸，充分搅匀，配平。 离心5 min,（2000r/min） （3）离心5：弃去上清液，核沉淀加5ml冰 三氯乙酸，充分搅匀，配平。 离心5 min,（2000r/min） （4）水浴（目的？） 取沉淀加5ml95%乙醇摇匀，置于60度-70度水浴锅中水浴10 min. 离心6：配平。 离心5 min,（2000r/min） 取沉淀加5ml95%乙醇摇匀 离心7：配平。 离心5 min,（2000r/min） （5）收集核酸 取沉淀加5ml0.3mol/L高氯酸液，转入试管内，置于90度水浴30 min，注意搅拌。 取出，转入离心管中，配平。离心8：配平。 离心5 min,（2000r/min） 取出收集上清液，弃去沉淀。而获得核酸 *