富铁酵母细胞的培养及其在治疗缺铁性贫血中的应用-海洋生物学专业论文.docx

万方数据 万方数据 独 创 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他 人 已 经 发 表 或 撰 写 过 的 研 究 成 果 ， 也 不 包 含 未 获 得 （注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 --------------------------------------------------------------------- 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学―中 国学术期刊(光盘版)电子杂志社‖用于出版和编入 CNKI《中国知识资源总库》， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签字： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 万方数据 万方数据 富铁酵母细胞的培养及其在治疗缺铁性贫血中的应用 摘 要 铁是人体必需的微量元素，在人体的代谢活动中具有十分重要的作用，铁缺 乏会引发缺铁性贫血。口服硫酸亚铁是治疗缺铁性贫血的传统方法，但硫酸亚铁 对胃肠道刺激性较大，患者很难坚持服用，因而影响治疗效果。富铁酵母具有吸 收率高、刺激性小、营养丰富等特点，作为一种安全高效的新型铁剂引起了人们 的关注。 从 40 株 Aureobasidium pullulans HN6.2 敲除了 GATA 类型转录抑制因子编 码基因（SRE1）的敲除菌株中筛选得到一株富铁能力最强的菌株 R6，R6 菌株在 加铁培养基中依然能产生大量铁载体，细胞内外铁载体总产量约 12.2 mg/g dw， 而野生型菌株在加铁环境中铁载体合成受到强烈阻遏。利用 R6 菌株这一特性， 通过优化加铁的时间，初步得到了富铁酵母细胞的制备方法：在缺铁培养基中培 养 R6 菌株，培养至 24 h 时加入终浓度为 1.5 mM 的 FeCl3，继续培养至 120 h， 收获富铁酵母细胞。在 50 mL 摇瓶体系中，R6 菌株胞内铁离子富集量最大可达 11.9 mg/g dw。 分别用加铁和缺铁培养基培养野生型及 R6 菌株，通过实时荧光定量 PCR 的 方法研究鸟氨酸羟基化酶基因（SIDA）在两种培养条件下的相对表达量。野生 型菌株在加铁培养基中的 SIDA 基因表达量是缺铁培养基中的 27.3%，R6 菌株在 加铁培养基中的 SIDA 基因表达量是缺铁培养基中的 74.1%，说明 R6 菌株部分 解除了铁离子对 SIDA 基因表达的阻遏作用。铁离子阻遏的解除使敲除菌株 R6 在加铁培养基中铁载体产量高于野生型菌株，因而能富集更多的铁。 对富铁酵母进行扩大化培养。在 1.5 L 发酵体系中 R6 菌株胞内铁离子富集 量为 5.15 mg/g dw。为提高 R6 菌株铁离子的富集量，在 50 mL 摇瓶体系中对加 铁浓度进行优化，得到铁离子最适终浓度为 15 mM。采用优化后的加铁浓度进 行 6 L 体系发酵培养，R6 菌株胞内铁离子富集量最高可达 27.79 mg/g dw。发酵 48 h 时，R6 菌株胞内铁离子富集量已达 26.59 mg/g dw，且总糖已消耗 96%以上， 在这种情况下可提前结束发酵，这大幅度缩短了富铁酵母的制备时间。 将富铁酵母试用于小鼠缺铁性贫血的治疗。首先采用急性毒性实验对富铁酵 母的安全性进行评价。对健康小鼠一次性灌胃 10 g/kg 富铁酵母，连续观察 14 I 天，小鼠未出现中毒和死亡，表明富铁酵母安全无毒。通过低铁饮食辅以慢性失 血的方法成功制备了小鼠的缺铁性贫血模型，贫血小鼠血红蛋白含量降为 89 g/L，红细胞计数降为 5.9×1012 cells/L。与正常小鼠相比，模型小鼠体重增长缓 慢，表明铁缺乏影响了小鼠的正常生长。对贫血模型小鼠连续 10 天灌胃富铁酵 母混悬液，10 天后贫血小鼠血红蛋白含量恢复至 128 g/L，红细胞计数恢复至 7.5 ×1012 cells/L。富铁酵母能显著提高缺铁性贫血小鼠的血红蛋白含量和红细胞计 数（P0.05），证明富铁酵母对缺铁性贫血小鼠具有良好的治疗效果。 关键词：普鲁兰短