珙酮叶片cDNA文库构建-林木遗传育种专业论文.docx

中南林业科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所里究的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以林挂号|用的内容外，本论文不包含任何其 它个人或集体已经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技大 学成其它教育机构的学位成证书所使用过的材料.对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法 律后果由本人承担. 作者签名:启字戎 2Jog 年 6 月也日 中南林业科技大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门戚机构送交论文的复印件或电子版，允许论文被蜜阅或 借阅.本人授权中南林业科技大学可以将本学位论文的全部成部分内容编入 有关数据库进行检索，可以来用影印、缩印成拘捕等复制手段保存和汇编本 学位论文. 本学位论文属于 1 1、 保密口，在年解密后适用本授权书- 2、 不保密 d。 (请您在以上相应方框打 .J ) 作者签名:启守宪 导师签名: 射 03年 6 月 日 vt年 6 月lh日 联榈叶片 cDNA 文库构建 摘要 烘桐为第三纪古热带植物区系的手遗种，为国家一级保护珍稀濒危植物， 也是世界著名的观赏木本花卉。到目前为止，关于烘桐宏观研究的报道已有许 多，但是关于跌桐分子方面的蕃础研究相对缺乏。为了探讨跌榈含有的特有种 属基因，保存跌桐的资源信息库，本论文实验构建了跌桐叶片组织全妖 cDNA 文晖，并对文库的质最进行了初步鉴定。 本论文实验以烘桐叶片为研究材料，采用 Trizol 法和 Rneasy Plant Mini Kit 法提取洪桐叶片组织总 RNA ，检测结果表明用Rneasy Plant Mini Kit 法提取的效 果较好.基于此结果本实验用 Rneasy Plant Mini Kit 法提取政桐叶片总 RNA 为 SMART ? cDNA Library Construction Kit 的起始材料合成全长 cDNA 并连接到 à TriplEx2 载体上， Gigapack@ 111 Gold Packaging 包装重组 λDNA 。包装好的嘴 菌体颗粒侵染 E. coli XLI-Blue 、BM25.8 大肠杆菌，成功构建了烘桐叶片组织的 cDNA 文库 跌桐叶片总 RNA 反转录成单链 cDNA ，长距离PCR 方法合成双链 cDNA; PCR 产物经蛋白酶 K 消化后，用 SfiI 酶切:将酶切产物进行分级分离，回收 0.5kb 以上的 cDNA 组分，并与 λTriplEx2 载体连按:连接产物经体外蛋白包装，产 生原始文库:鉴定文库的滴度和重组效率后，进行文库扩增和保存。随机挑取 40 个噬菌斑，用载体克隆优点两端的通用号|物进行 PCR 扩增，以检测所构建的 cDNA 文库的质量。经测定该文库初始滴度为 6.3 X 106 pfu/ml ，重组率为97.4%; 扩增后滴度为 5. 16x l07pfu/ml; 插入片段长度为 0.4_2.0胁。由于反转录过程中 采用附加序列的方法使全长mR NA 得到反转录，所以得到的 cDNA 是完整的， 完全符合 cDNA 文廊的要求。通过对 cDNA 文库的质量检测，文库中插入片段 长度的长度、文库的滴度以及重组率都符合 cDNA 文库的要求。 跌榈叶片入睡菌体 cDNA 文库的成功构建，为进一步开展琪桐 EST 文库构 建及目的基因克降功能基因组研究奠定了物质基础。 关键词:烘桐; RNA 提取; cDNA 合成; cDNA 文库 琪桐叶片 cDNA 文库构建 ABSTRACT Dove tree (Dαvidia ínvolucrate) is not only the relict species in tertiary ancient tropical flora but also the first-grade state protection of rare and endangered species. Whats more，it is the most populer viewing woody flower. Untill now，there are lots of repo此s relevant to macroscopic view of Dove tree and few reports relevant to molecular leave. To study special kind gene and preserve resource information library of Dove tree，the fullωlength