副溶血弧菌诱导的Notch分子参与天然免疫应答作用的初步研究-临床兽医学专业论文.docx

上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学硕士学位论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 王印庚 黄海水产研究所 研究员 主席 杨先乐 上海海洋大学 教授 委员 陆宏达 上海海洋大学 教授 委员 委员 委员 委员 委员 李怡 上海海洋大学 讲师 秘书 答辩地点 生命学院病原库 D101 答辩日期 2015.06.07 副溶血弧菌诱导的 Notch 分子参与天然免疫应答作用的 初步研究 摘 要 副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)是目前备受关注的人畜共患病的病原， 不仅是水生动物弧菌病(Vibriosis)的重要病原，而且也是一种常见的食源性致病菌， 极易引起食物中毒，严重的可引起肠胃炎等疾病。此外，Vp 还可能引发伤口感染， 严重的可导致败血症甚至死亡，对人类健康危害巨大。而斑马鱼作为最重要的模 式脊椎动物之一，在受精之后的 3 周时间内只存在“天然免疫”系统，具有在器官 水平和个体水平上研究天然免疫应答的独特优势。 本实验主要以斑马鱼为模型，用 Vp 感染斑马鱼来检测不同来源的人类致病株 及水产动物致病株的毒力大小，得到的强毒力菌株 Vp13 用于探究 Notch 信号分子 及炎性因子、细胞因子及 TLR 信号通路上的关键因子在感染斑马鱼胚胎或幼体中 的表达量变化，初步探究 Notch 分子参与天然免疫应答的作用。为了进一步探究 Notch 信号在 Vp 感染斑马鱼胚胎中的作用机制，我们利用 CRISPR/Cas9 基因编辑 技术成功获得了 notch1a 及 notch1b 的突变体，为后续感染机制的深入研究提供了 宝贵材料。本研究的主要成果有：1）本文以 Vp 为研究对象，建立了成年斑马鱼 的感染模型，对人类致病菌株 ATCC17802、Vp-KCN、ATCC33847 及水产动物致 病菌株 Vp13、Vp31、Vp41、Vp57 共 7 株 Vp 的毒力进行比较，分别用累积法及 Bliss 法计算 LD50，发现毒力强弱的顺序均为：Vp13 ATCC33847 ATCC17802 Vp57 Vp31 Vp41 Vp-KCN。将毒力最强的 Vp13 菌株用于后续实验。2）用 Vp13 菌株采用浸泡的方式感染 1dpf、2dpf、3dpf 和 5dpf 的野生型斑马鱼胚胎/幼鱼， 利用 Q-PCR 方法检测感染后 1h（hour post infection, hpi），2 hpi，4 hpi，8 hpi，12 hpi 后 Notch1 受体(notch1a, notch1b)、Notch 配体(delta a，delta b, delta c )、炎性细 胞因子（il1b、il10、il6、tnfa 及 ifnphi）、趋化因子（ccl-c5a、cxcl-8a）和 TLR 信 号通路上的关键因子(tlr2、tlr4、myd88、mmp9 及 hey1)在转录水平的表达量变化。 研究结果提示：用 Vp13 浸泡感染 1dpf、2dpf、3dpf 和 5dpf 的斑马鱼胚胎/幼鱼， 结果提示：3dpf 的斑马鱼胚胎感染 Vp13 后 notch1a、notch1b 及 4 种配体变化趋势 相似，均先降低后升高，在 4hpi 时达到最小值。notch1a 及 notch1b 对 TLR 信号通 路表现出负向调控作用。确定 Vp13 感染 2dpf 斑马鱼胚胎后 4h notch 基因表达量 I 最高。Vp 能够激活 Notch 信号通路。提示其可以参与天然免疫应答反应，为之后 继续的转录组测序研究以及深入研究 Notch 信号在先天免疫中的作用机制提供了 一定的理论依据。3）为了进一步验证 Vp13 所引起的斑马鱼天然免疫应答反应中 Notch 分 子 的 作 用 机 制 ， 我 们 利 用 CRISPR/Cas9 基因 编辑 技术成功制备了 notch1a 和 notch1b 基因敲除的斑马鱼突变体，为进一步深入研究 Notch 分子参与 的天然免疫应答机制提供了很好的实验材料。此 Cas9/gRNA 系统可以对 notch1a、 notch1b 产生不同类型的突变，而且突变的效率高达 70%以上。与 ZFN 或 TALEN 相比较，我们所运用的 Cas9/gRNA 系统是一种更简单、更经济的基因编辑方式， 并且可以更有效地产生特定位点的 indels（insert/deletion）基因突变。 总而言之，Vp 所致疾病的控制措施直接影响病程的长短，在发病早期，机体 采取天然免疫应答机制对抗感染，成为现代医学的研究焦点。本研究以 Vp 为对 象，建立了斑马鱼成鱼和幼鱼感染的动物模型，在分子水平上初步研究 Notch 分 子参与天