副鸡禽杆菌外膜蛋白gcbG的原核表达及荚膜转运基因HctC缺失株的构建预防兽医学专业论文.docx

I I 副鸡禽杆菌外膜蛋白 gcbG 的原核表达及荚膜转运基因 HctC 缺失 株的构建 摘 要 鸡鼻炎是由副鸡禽杆菌引起的以鸡肿头肿脸为主要症状的急性呼吸道传染病，主要 引起育成鸡生长发育受阻和淘汰率增加，且造成蛋鸡产蛋量明显下降，给我国养禽业造 成了巨大损失。因此，进行 Apg 新型疫苗的研发，研制出对鸡安全、有效并能迅速产生 免疫力的基因工程疫苗为当前研究的主要任务。 本研究对 B 型标准株 gcbG 基因进行了克隆、测序，大小为 495bp，将其插入 pGEX-5X-1 原核表达质粒中，构建 pGEX-5X-gcbG 原核表达载体，转化大肠杆菌 BL21 （DE3）感受态细胞，获得 gcbG 蛋白原核表达菌株；对 gcbG 蛋白进行表达、最佳表达 条件的优化以及表达产物的免疫原性分析，结果表明，本实验成功地在体外表达了 APg 血清 B 型 gcbG 蛋白，大小约为 44ku,该蛋白在 IPTG 浓度为 1 mM/L，温度为 28℃，表 达时间为 5h，表达量最高，且为包涵体表达。纯化 gcbG 重组蛋白包涵体，进行 Western blotting 检测，结果表明，目的蛋白与 Apg 鸡阳性血清有特异性免疫反应。 对 B 型标准株 HctC 基因进行了克隆、测序，大小为 1164 bp，以副鸡禽杆菌标准株 0221 为实验基础，利用转座子采用定点克隆的方法，扩增其全长片段，将其连入 pGEM-T 载体，通过反向 PCR 并反向自连后获得基因缺失片段，将基因缺失片段转入 pemoC2 自杀质粒构建基因缺失转移载体。在成功构建基因缺失转移载体的基础上，将其电转入 副鸡禽杆菌感受态细胞中，通过自杀质粒介导的同源重组方法得到副鸡禽杆菌 HctC 基 因缺失株。结果表明，Apg 基因缺失菌株菌体形态与野生菌株无显著差异，生长速度并 未受明显影响。 关键词：副鸡禽杆菌；GcbG 基因；HctC 基因；基因缺失菌株 II II Prokaryotic expression of outer membrane protein gcbG of Avibacterium paragallinarum and Construction of its mutant with capsule transporter gene HctC deleted Abstract Infectious coryza,caused by Avibacterium paragallinarum ,is an acute respiratory disease of chickens with cardinal symptom Head Tumidness. This disease causes growth impediment and raises eliminating rate for chickens, which has led to a great loss for China Poultry Industry. Therefore research on the development of new-type genetic engineering vaccine which is safe, effective in producing immune reaction, is a main task at present. We cloned and sequenced the gcbG gene of Type B standard strain ,which is 495bp , constructed recombinant pmkaryotic expression plasmid pGEX-5X- gcbG , transformed it into E. coli BL21(DE3) ,got the expression bacterial strain;Then we expressed the gcbG protein , optimized expression condition and did immunogenic analysis , the results showed that we succeeded in expressing gcbG protein.,which is 44ku and was mainly present in inclusion .Its optimum condition of the expression is IPTG 1 mM/L,temperature 28℃, induction time 5h. To purify recombinant