儿茶素与表儿茶素没食子酸酯联合后在体内外增强β内酰胺类抗生素抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的作用及作用机制研究.docVIP

儿茶素与表儿茶素没食子酸酯联合后在体内外增强β内酰胺类抗生素抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的作用及作用机制研究 儿茶素与表儿茶素没食子酸酯联合后在体内外 增强β内酰胺 类抗生素抗耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌的作用及作用机制研究 蒋薇薇 彭 伟 周 红覃容欣 肖康康 李 斌 第三军医大学药学院药理学教研室，重庆400038 目 的 前 期研 究 发现 儿茶 素(C)和 表儿 茶素 没 金子 酸酯 (ECg)联合耐后在体 外可以显著增强苯唑西林 抗甲氧西林金葡菌( MRSA)的作用，因此， 该研究旨在探讨这两种化合物具有抗菌增敏作用的最佳配伍剂量， 在这个剂量下， 对MRSA临床分离株的作用及其可能的机制。 方法 以二倍稀释法观察C、 ECG和几种β内酰胺类 抗生 素单独对MRSAWHO-2菌株的最低抑菌浓度(MIC)， 以棋盘法测定C和ECG联合β内酰胺类抗生素后对MRSA WHO-2菌株和45株MRSA临床分离株的MIC;以生物传感器测定PBP2a蛋白和C、ECg的亲和力;以荧光分光光度计 法和 激光共聚焦扫描显微镜法观 察C和ECG单独及联合后对柔红霉素在MRSAWHO-2菌株菌体聚集的影响;以 RT-PCR方法观察C 联合对外排泵基因表达的影响; 建立亚致死剂量脓毒症模型小鼠， 用菌落计数 和ECG单独及 的方法观察C和ECg联合后对脓毒症模型小鼠外周血内细菌数量的影响。 结果 C和ECg单独没有抗菌增敏作用， CE(128 μg/mLC和 16μg/mLECg)可以显著增强β内酰胺类抗生素抗MRSA的作用，而对非β内酰胺类抗生素无 效;CE可以增加柔红霉素在细菌菌体内的聚集，降低外排泵norA，norC,abcA基因水平的表达;更重要的是，CE可 以降低亚致死剂量脓毒症模型小鼠外周血内细菌数量。结论 CE可以在体外内增加β内酰胺类抗生素抗MRSA的作 用，可能与其增加药物在细菌菌体内的聚集，降低外排泵的基因表达水平有关。 儿茶素;表儿茶素没食子酸酯;联合作用;药物积聚;外排泵 中国药理学会第十一届全国化疗药理学术研讨会论文集188 于减少耐药菌株的产生【8 】。 I【l?，柯里 天然植物是此类药物的巨大宝库。如从黄芩苷【9l，二萜化合物【l叭，tellimagrandin 拉京‘12】，三萜化合物‘13】，EGCg[141和ECg【15。161等都能明显增强MRSA对抗生素的敏感性。其中， EGCg和ECg属于儿茶素类化合物，广泛存在于天然植物特别是绿茶中，它们自身没有抗菌作用， 71。因此，它们被称为B内酰却可以显著增强p内酰胺类抗生素抗MRSA的作用[1 胺类抗生素 增敏剂(ILSMR)【博】。 我们长期从事从传统中药中寻找抗菌增敏剂的研究，前期，以抗菌增敏活性为导向，从中药 山楂中筛选得到具有增强B内酰胺类抗生素的活性组分，并从中分离得到2个单体化合物命名为 儿茶素和表儿茶素没食子酸酯。我们发现，C和ECg单独使用并不具有抗菌增敏作用，但C联合 ECg具有显著的抗菌增敏作用，这与文献报道不一致[15-16]o本研究旨在探讨这2种化合物具有抗菌 增敏作用的最佳配伍剂量和体内外药理学作用及其可能作用机制机制。 材料与方法 一、实验材料 儿茶素(C)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)(结构式如图1所示)购自上海阿拉丁试 剂有限公司(纯 度三98,，旋光度分别为26。和(1330，体外实验用1,(v,v)DMSO溶解，体内实验用0(5,(w,v) 羧甲基纤维素钠溶解;苯唑西林、头孢唑林、氨苄西林、头孢吡肟、亚胺培南(西司他丁等抗生素 分别购自西南制药公司、华北制药股份有限公司、美国Genview公司、海南斯达制药有限公司、珠 海联邦制药有限公司;柔红霉素购白Pharmacia S(P(A公司;DMSO购自成都科龙化工Italy 试剂厂。 RT试剂盒购买于宝生物技术有限公司Mueller-Hinton(MH)琼脂和MH RNAiso和PrimeScript 液体培养基购买于OXOID生物技术有限公司;PCR引物合成于上海英骏公司。 金葡菌临床分离株由第三军医大学附属西南医院国家药品临床研究基地提供，WHO(2菌株为 第四军医大学罗晓星教授惠赠;96孔培养板购于NEST公司;MH培养基购自北京奥博星生物技 术有限公司;紫外分光光度计、全波长分光光度计购自Bio—Rad公司;自动旋光仪购白上海申光 仪器仪表有限公司，型号:WZZ(2B;激光共聚焦扫描显微镜购自德国Zeiss公司，型号: META，安装LSM软件。 510 LSMSPF级昆明小鼠(4-6周，体重18-22 g购买于第三军医大学实验动物中学，雌雄各半。关于动 物的所有实验操作均得到第三军医大学医学伦理委员会批准。 二、最低抑菌浓度(MIC