抗牛病毒性腹泻病毒siRNA和miRNAs功能基因筛选和评价.pdf

ScreenandevaluationoffunctionalsiRNAandmiRNAgenesagainst ScreenandevaluationoffunctionalsiRNAandmiRNAgenesagainst SSccrreeeennaannddeevvaalluuaattiioonnooffffuunnccttiioonnaallssiiRRNNAAaannddmmiiRRNNAAggeenneessaaggaaiinnsstt bovineviraldiarrheavirus bovineviraldiarrheavirus bboovviinneevviirraallddiiaarrrrhheeaavviirruuss ADissertationSubmitted to Shihezi University Shihezi University SShhiihheezzii UUnniivveerrssiittyy fortheDegreeof DoctorofAgriculture DoctorofAgriculture DDooccttoorrooffAAggrriiccuullttuurree (AnimalGeneticsBreedingandReproduction) (AnimalGeneticsBreedingandReproduction) ((AAnniimmaallGGeenneettiiccssBBrreeeeddiinnggaannddRReepprroodduuccttiioonn)) June,2013 Shihezi,Xinjiang,China 摘 要 牛病毒性腹泻病毒（bovineviraldiarrheaviruses，BVDV）是牛病毒性腹泻-粘膜病 的主要抗原，该病在世界各国都有比较普遍的发生和存在。该病对我国养殖业同样构成 严重危胁。因此，国内、外对BVD的防治都非常关注。但是目前针对BVDV感染尚无 特异性的预防疫苗、治疗方法和抗病毒药物。因此建立新的抗病毒方法，控制病毒的扩 散具有重要意义。利用转基因技术进行抗病育种已成为研究热点，而抗病候选基因的克 隆和验证是转基因新品种培育中急待解决的关键问题。本研究从两个角度开展抗BVDV 功能基因研究：（1）靶向病毒基因设计siRNA，抑制BVDV增殖为目的，将RNAi技 术与转基因技术相结合，进行抗病毒功能基因研究，并在绵羊个体进行抗BVDV效果 评价，为制备抗BVDV转基因家畜动物奠定基础；（2）以修饰宿主抗BVDV功能基因， BVDV microRNAs miRNAs 提高 易感动物的抗病性能为目的，通过 （ ）的差异表达分析， 筛选宿主抗BVDV功能基因，为我国抗病转基因新品种培育和产业化提供基因资源。 pro 首先，设计靶向BVD病毒N 、C、NS3、NS4B、NS5A基因的shRNA干扰片段， 构建相应的shRNA干扰载体pu6-sh1…pu6-sh9，分别转染MDBK细胞，48h后接种 BVDV，Real-timePCR与病毒滴定测定的方法并用，测定干扰载体的抗病毒效率。结果 显示pu6-sh3、pu6-sh8的干扰效果较好，最高干扰效率可达88.5%。为进一步提