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豌豆基因组SSR标记在蚕豆中通用性分析 　　摘要：分析了２１对豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）基因组ＳＳＲ引物在１０个蚕豆（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）品种中的通用性。结果表明，豌豆基因组ＳＳＲ引物在蚕豆中的通用性达３８．１０％，有效引物在蚕豆品种中的多态性比例为１００％。 　　关键词：豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）；蚕豆（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）；ＳＳＲ；通用性 　　中图分类号：Ｓ６４３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）01－0185-03 　　 　　Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｅａ ＳＳＲ Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Horsebean 　　 　　ＨＯＵ Wａｎ－ｗｅｉ，ＬＩＵ Ｙｕ－ｊｉａｏ 　　（Ｑｉｎｇｈａｉ Ａｃａｄｅｍy ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ＆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｘｉｎｉｎｇ ８１００１６，China） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ２１ pairs of ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ of ｐｅａ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ） ｉｎ ｈｏｒｓｅｂｅａｎ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ） ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｅａ ＳＳＲ ｉｎ ｈｏｒｓｅｂｅａｎ ｗａｓ ３８．１０％， ａｎｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｒａｔｅ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ＳＳＲ ｉｎ ｈｏｒｓｅｂｅａｎ ｗａｓ １００％． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｅａ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）； ｈｏｒｓｅｂｅａｎ（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）； ＳＳＲ； ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ 　　简单序列重复（Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔｓ，ＳＳＲ），是一类由１～６个碱基组成的基序（ｍｏｔｉｆ）串联重复而成的ＤＮＡ序列，它在真核生物的基因组中广泛存在，其基序两端的序列多是相对保守的单拷贝序列［１］。与其他分子标记相比，ＳＳＲ标记具有数量丰富、等位基因变异多、共显性遗传、重复性强和对基因组有很好的覆盖性等特点，已被广泛应用于基因定位、品种鉴定、图谱构建、种子纯度检测及遗传多样性分析等［２－６］。ＳＳＲ引物的获得可以通过３条途径：一是在公共的序列数据库（ＧｅｎＢａｎｋ）里寻找微卫星序列；二是基因组文库的筛选；三是从近缘物种中获得已设计好的引物对［７］。为了降低ＳＳＲ引物的开发成本，近年来很多学者对ＳＳＲ引物在不同种、属物种间的通用性进行了深入研究［８－１6］。本研究对２１对豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）基因组ＳＳＲ引物在蚕豆中的通用性和多态性进行初步研究，以快速找出可用于蚕豆（Ｖｉｃｉａ ｆａｂａ）遗传多样性分析、分子标记辅助育种等研究的分子标记。 　　１ 材料与方法 　　１．１ 试验材料 　　供试蚕豆品种为：青海９号、青海１１号、青海１２号、马牙、陵西一寸、法Ｄ、透心绿、双“０”、湟饲、１３０。使用ＺＯＮＧ等［１７］报道的２１对豌豆ＳＳＲ引物（表１），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　１．２ ＤＮＡ提取与ＳＳＲ分析 　　１．２．１ 蚕豆基因组ＤＮＡ提取 取蚕豆幼嫩叶片约１ ｇ，加液氮研磨至粉末状，加入装有０．８ ｍＬ ＤＮＡ提取缓冲液［１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）＋１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ ８．０）＋２．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ＋２％ ＣＴＡＢ＋２％ ＰＶＰ］的１．５ ｍＬ离心管中，６５ ℃水浴４５ ｍｉｎ后加入等体积氯仿／异戊醇（体积比为２４∶１）混匀，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，将上清液转入另一离心管中，加入等体积无水乙醇。冰上静置２０ ｍｉｎ，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上清，用７５％乙醇清洗沉淀３次，风干后加入４００ μＬ ＴＥ溶解，－２０ ℃保存备用。 　　１．２．２ ＰＣＲ反应及产物检测 ＳＳＲ反应体系（２０ μＬ）包括Ｍｇ２＋ ２ μＬ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶１ Ｕ、ｄＮＴＰ各２００ μｍｏｌ／Ｌ、１０ μｍｏｌ／Ｌ上下游引物各２ μＬ、模板ＤＮＡ ２００ ｎｇ。反应程序为：９４ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，复性１ ｍｉｎ（６０ ℃起，每循环降低１ ℃），７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，１０个循环；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，５０ ℃复性１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，２２个循环；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，４ ℃保存。 　　扩增产物中加入５ μＬ溴酚蓝混匀，取５ μＬ在６％非变性聚丙烯酰胺凝胶中２００ Ｖ恒电压电泳９０ ｍｉｎ。电泳结束后用蒸馏水漂洗凝胶２次；加入染色液（０．２％ＡｇＮＯ３＋１％冰醋酸＋１０％无水乙醇）银染１５