食管鳞癌发生发展过程中增殖和凋亡相关基因的分析与凋亡的同步原位检测.pdf

却与之相反。p27基因以多种方式参与细胞周期的调控，是～种多 功能的CDKI，通过多种方式参与细胞周期调控，最终抑制细胞的 分裂和增殖，促进细胞的分化。目前普遍认为p27kipl是一种抑癌 基因，4i少报道证实p27的表达与肿瘤的生物学行为分化程度、临 床分期、淋巴结转移及预后相关[61。但Fero等【71认为目前尚不能 管鳞癌的晚期病变和低生存率呈正相关，因此对p27的研究尚属初 级阶段，在p27是否为合格的抑癌基因的问题上还存在着分歧，国 内关于p27的研究报道较少。野生型p53既是一种肿瘤抑制基因， 又是细胞周期的重要调控者，N时又是凋亡的中介者，突变型p53 达将细胞周期阻抑于Gl期，以有利于损伤DNA的修复，若DNA 不能修复则可通过上调Bax表达和下调bcl一2表达等机制诱导细胞 凋亡，以维持遗传的稳定性，wtp53功能缺失可见于50％以上的人 体恶性肿瘤。P53基因突变和p53蛋白聚积在食管癌中的临床意义 也存在争议15’“J。bcl-2基因是一个广义的抗凋亡基因，既是癌基 因，又是抗凋亡基因，bcl一2通过广泛抑制各种刺激剂诱导的细胞 凋亡，延长细胞活力丽发挥生物学作用，研究显示：bcl．2之表达 o，151，Mario 与多种肿瘤的发生和恶性生物学行为有关【1 S【8】等虽认 为bcl一2的表达与肿瘤低分化有关，但同时认为bcl．2表达在食管 癌中好像仅有有限的I晦床重要性，不能作为预后因子。 综上所述，食管癌的发生发展及临床生物学行为可能与多种基 因变化相关，但目前的研究多局限于单个或2个基因的研究，并且 结果不一，尤其是样本量较少，缺乏系统性的对比研究，故采取大 样本进行多个基因蛋白的综合研究，对阐明食管癌的发生、发展机 制具有重要意义。 本研究收集了1996年5月～2000年5月新乡医学院第三附属 医院、新乡市中心医院、安阳市肿瘤医院手术切除并经病理证实的 食管鳞癌标本72例(每例均包括正常粘膜上皮、非典型增生和浸 润癌)，应用免疫组织化学方法检测食管鳞癌发生发展过程中(正 常粘膜上皮一非典型增生一浸润癌)增殖、凋亡相关基因(p27、 p5 亡的变化，以期从分子水平探讨食管癌发生发展的机制，寻找早期 诊断和判断预后的分子指标。 实验材料 一、标本 材料来自新乡医学院第三附属医院、安阳市肿瘤医院、新乡市 中心医院1 鳞癌标本，筛选出符合研究要求的标本(每例均包括正常鳞状上皮、 非典型增生和／或原位癌、浸润癌)72例，其中男性38例，女性 34例，最小年龄37岁，最大年龄76岁，平均55岁。术前均未化 疗或放疗，术后立即取材，常规中性1O％福尔马林液固定、石蜡包 u 埋、连续5 m切片。 二、主要试剂 公司产品，购于北京中山生物工程公司。 2．生物素化II抗、辣根过氧化物酶标记的III抗、磷酸盐缓冲 酸、DAB试剂盒，均购于北京中山生物工程公司。 3．TUNEL染色试剂盒，为德国宝林曼公司产品，购于北京 中山生物工程公司 三、主要仪器设备 RM2l35 1．切片机，德国产Leica u1，200ul，20u1，10u 2．各种移液器，(1000 1)；eppendorf， 购于北京华美生物工程公司。 3．微波炉，广东顺德产。 R 实验方法 一、切片准备 将购买的载玻片清洗，泡酸再清洗后，放入1：10比例去离子 水稀释的L，多聚赖氨酸溶液中浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤1小时， 装盒备用。 二、组织切片制作 术后立即取材，常规1O％中性福尔马林固定、脱水、透明、浸 蜡、包埋、切片并附贴，切片厚度5um。 三、免疫组化染色 I．二甲苯脱蜡：二甲苯I一二甲苯II一二甲苯III各20分钟。 2．酒精浸水：酒精100％×2—95％一75％一50％各2分钟。 3．用PBS液浸洗3次，各5分钟。 4．3％过氧