毛细管电色谱分离蛋白质及多肽.PDF

毛 细 管 电 色 谱 分 离 蛋 白 质 及 多 肽 摘要： 这项研究描述了一种新的毛细管电色谱方法，该方法用熔融硅毛细管内部蚀刻柱，再经过后序 的硅烷化 / 氢化硅烷化反应处理，两种不同的有机物，十八烷基和二醇基，被附在蚀刻过的毛细管内壁 上，这两种柱子同空管柱用于多肽（血管紧张肽）和蛋白质的分离情况的比较，从而得出蚀刻过程充分 地增加了内壁的表面积和溶质与键合相间相互作用的结论，因为毛细管被十八烷基和二醇基改变了性 质，这两种改性柱的分离能力是不同的，估计是因为两种配位体的化学性质的不同，与空管柱中的分离 仅依靠电泳速度不同，相同的物质在相同的实验条件下，不同键合相蚀刻毛细管柱中的分离因子是不同 的。 关键词：电色谱；毛细管柱；蛋白质；多肽 1. 引 言 ： 毛细管电色谱(CEC) 是一种集高效毛细管电泳（HPCE ）和高效液相色谱（HPLC ）的分离机制于 一体的方法，它的溶质流动是通过一个电驱动原理，分离机制是不仅依靠溶质—固定相间的反应作用， 还有电渗流的作用。在最普通的毛细管电色谱模式中，毛细管填充了化学改性的硅胶颗粒，固定相如同 HPLC 中一样。一个柱塞，置于溶质到达检测窗口之前的位置，以用于阻止固定相的流失和光信号的失 真。塞子和固定相颗粒都可能导致气泡的产生，从而导致电渗流的中断，为了最大限度地减少气泡产生 的可能性和排除堵塞，这在小直径的管子内是很困难的，因此发展了一种在毛细管内壁蚀刻的毛细管电 色谱方法，这个过程同在气相色谱中为了增加毛细管柱内壁表面积而涂上一层聚合物的方法相似，在精 确控制的温度和反应时间下使用了二氟化氢铵作蚀刻剂。较早的研究描述在 300-400 ℃时蚀刻毛细管 3-4 小时，这些条件明显地增加了表面积，从而充分地增大了蛋白质、多肽和四环素与十八烷基固定相 间的分配因子（在溶质和蚀刻柱内壁上的有机部分之间）。 用有机物蚀刻毛细管的方法是以硅烷化—氢化硅烷化反应为基础的，在这个过程中，毛细管中被蚀 刻过的表面先同三乙氧基甲硅烷反应，以产生一个氢化物表面，在理想的条件下，一单层三乙氧基甲硅 烷被沉淀在柱子表面，以致大部分硅烷醇被氢化物取代，然后通过注入一种含有烯烃的溶剂和一种适合 的催化剂，如六氯铂酸，让其流过毛细管，有机成分就立即被附在氢化物上，这个过程被称作氢化硅烷 化过程，在前面的研究中，被使用的烯烃为1-十八烯烃，硅烷化- 氢化硅烷化反应方法也被用于毛细管 电泳中未蚀刻的毛细管柱，以涂附丙烯酰胺聚合物。键合方法的一个好处是在有机部分和表面间形成了 一稳定的硅—碳键合层。实验证明聚合丙烯酰胺毛细管通过氢化物间接键合比有机硅烷化更稳定，在这 个研究中，被蚀刻的毛细管首先被氢化物介质键合，随后和7- 辛烯基-1 ，2- 二醇(7-OD)或1-十八烯烃反 应，以产生适合于电色谱的柱子，在HPLC 中7-OD 键合材料已经表现出了比二醇基更小的疏水性，以 致在用毛细管电色谱分离混合物产生更适合的特性，在这些混合物中，一个适合的介于疏水性和亲水性 间的平衡是必不可少的，例如生物分子。 2. 实 验 过 程 ： 2.1 材 料 ： 溶菌酶（火鸡和小鸡的蛋清），细胞色素C ( 马和牛的心脏) ，核糖核酸酶A （牛的胰脏）， myglobin 和血管紧张肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，从Sigma 公司采购，缓冲液包括：30mM 磷酸盐， PH 为2.14 （Fischer Scientific ）；19mM Tris 试剂（Sigma ）;30mM柠檬酸， PH 为 3.0 （Sigma ）;25mM β - 氨基丙酸（Sigma ）;30mM 乙酸，PH 为4.41 （Aldrich, Milwaukee, WI, USA ）和30mM γ– 氨基丁 酸（Sigma ）, 去离子水从一台 Milli-Q 水纯化系统获得（ Millipore, Bedford, MA, USA ），然后通过 一层0.2um 的尼龙66薄膜过滤器过滤（ Alltech Assoc., Deerfield, IL, USA ），用于蚀刻毛细管的二氢氟 化铵，购自 Aldrich 公司；三乙氧基甲硅烷、1-十八烯烃、 7-OD 和六氯铂酸（催化剂）、用于蚀刻柱 后序改性的物质，也购自Aldrich, 使用的毛细管为外径375um 、内径50um （Polymicro Technologies, Phoenix, AI, USA ）。 2.2 仪 器 ： CEC和HPCE 的实验