环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌O157︰H7的研究-食品加工与安全专业论文.docxVIP

分类号： 单位代码： 密 级： 学 号： 非全日制硕士专业学位论文 环介导等温扩增技术快速检测肉类中 的大肠杆菌 O157︰H7 的研究 Rapid Detection of Escherichia Coli O157:H7 in Meat Using an Improved Loop-mediated Isothermal Amplification Technology 学位申请人：刘道亮 指 导 教 师 ：张 伟 校 外 导 师 ： 赵 占 民 学 位 名 称 ： 农 业 推 广 硕 士 研 究 领 域 ：食品加工与安全 授 予 单 位 ：河北农业大学 答 辩 日 期 ：二〇一二年十一月二十二日 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其它教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留及使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门（机构）送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查（借） 阅。本人授权河北农业大学可以将论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等方法加以保存或编成学位论文。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 摘 要 国内外检测 E.coli O157:H7 的方法很多，我国进出口食品对 E.coli O157:H7 目 前采用的方法是以行业标准 SNT0973-2010 作为依据。通过对样品增菌处理后，进 行平板划线，然后挑取可疑菌落进行形态、染色及血清学试验、生化鉴定等进行判 定。检测过程耗时长达 4～7 天，难以适应快速检验的要求。本研究针对 E.coli O157:H7, GenBank: S83460.1 编码 O157 抗原的 rfbE 基 因 序 列 和 GenBank: AF228487.1 编码鞭毛 H7 特异性抗原的 fliC 基因序列，运用在线引物设计软件 (https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)设计 LAMP 引物。对反应时间、反应 温度、镁离子浓度等扩增条件进行了优化。确定 25 μL 的 LAMP 反应体系是：内 引物（FIP 和 BIP）各 1.6 μm，外引物（F3 和 B3）各 0.2 μm，环引物（LF 和 LB）各 0.8 μm ，2.5 mmol/L dNTP，4 mmol/L MgSO4，10×Bst DNA 聚合酶反应 缓冲液，8 U 的 Bst DNA 聚合酶大片段，3 μLDNA 模板和用灭菌双蒸水补足体系。 确定 LAMP 反应过程是首先在 63℃水浴锅中反应 20 min，然后将其放入 80℃水浴 锅中，水浴 10 min 终止反应，通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀。此外，取扩增 产物进行 1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察梯形条带，以证实是否发生了 LAMP 反应。 改良 LAMP 检测 E. coli O157:H7 的纯培养物的灵敏度达到 1.4 CFU /mL。和人工污 染检出限达到 1.8 CFU/g。 比较了 6 种模板制备方法对 LAMP 检测肉及肉制品中 E. coli O157:H7 的影响。 研究表明 LAMP 方法对制备模板 DNA 的要求不高。采用热裂解法提取 DNA，不仅 提取时间将大大减少，而且也将大大降低检测成本。对 187 份实际样品同时进行改 良 LAMP 检测和依据 SNT0973-2010 进行常规检测，结果证明，两种方法符合率达 到 99.47%。 研究表明 LAMP 快速检测 E.coli O157:H7 方法，其灵敏度高，特异性好，简便， 快速，解决了传统检测方法耗时长、灵敏度低，血清凝集有交叉反应等问题，对于 及时有效应对食源性突发公共卫生事件具有重大意义。 关键词：环介导等温扩增；LAMP；检测；大肠杆菌 O157:H7；肉类 Rapid Detection of Escherichia Coli O157:H7 in Meat Using an Improved Loop-mediated Isothermal Amplification Technology Author: Liu Daoliang Supervisor: Zhang Wei Major