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PAGE7 / NUMPAGES10 淀粉酶活性的测定 植物098 原硕 0901080808 摘要：淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可以分成α-淀粉酶，β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的两种。β-淀粉酶存在于休眠的种子中，而α-淀粉酶是在种子萌发过程中形成的，淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，麦芽糖能将3,5-二硝基水杨酸还原成硝基氨基酸的显色基团，其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。 关键字：淀粉酶，活力测定 研究背景及目的： 酶大部分是由蛋白质构成，少数由核酸构成，能高效催化体新陈代谢各步反应的催化剂，几乎所有的生化反应都离不开酶的催化，所以酶在生物中扮演着很重要的角色，对酶的测定研究也就具有了很重要的意义。酶的活力是酶的重要参数，反映了酶的催化能力，因此测定酶的活力是研究酶的基础。 淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称，按照其水解淀粉的作用方式，可以分成α－淀粉酶，β—淀粉酶等。α－淀粉酶和β—淀粉酶是其中最主要的两种。β—淀粉酶存在于休眠的种子中，而α－淀粉酶是在种子萌发过程中形成的，本实验的目的在于掌握这两种酶的提取与测定方法。 研究依据及原理： α－淀粉酶和β—淀粉酶。β—淀粉酶不耐高热，在高温下容易钝化，而α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6下则发生钝化。在萌发种子的提取液中，这两种淀粉酶同时存在。本实验的设计利用这两种酶的不同特性加以处理，钝化其一，即利用β—淀粉酶不耐热的特性，在高温（70℃）下15min处理使得β—淀粉酶钝化，从而测定α－淀粉酶的活性。而测定β-淀粉酶时，可用pH 3.6的醋酸缓冲液处理提取液，以钝化α－淀粉酶。 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5-二硝基水杨酸试剂测定，由于麦芽糖能将后者还原成硝基氨基酸的显色基团，其颜色的深浅与糖的含量成正比，故可求出麦芽糖的含量。常用单位时间内生成麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性的大小。 在实验中要严格控制温度及时间，以减少误差，并在酶的作用过程中，四只测定管级空白管不用混淆。空白管作为对照组消除非酶反应带来的影响，以减少实验误差。 实验材料与方法： 实验材料：萌发的小麦种子（芽长1厘米左右） 仪器： 小台秤 研钵 容量瓶：50ml×1,100ml×1 具塞刻度试管：15ml×6 试管：8支 移液器 离心机 恒温水浴 分光光度计 试剂： （1）1%淀粉溶液，称取1克可溶性淀粉，加入80ml左右蒸馏水，在电炉上加热溶解，等冷却后，定容到100ml （2）pH5.6的柠檬缓冲液： A液：称取柠檬酸20.01克，溶解后定容到1升 B液：称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容到1升 取A液5.5毫升、B液14.5毫升混均，即为pH5.5柠檬酸缓冲液。 （3）3,5-二硝基水杨酸溶液： 称取3,5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml1M氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。 （4）麦芽糖标准液： 称取麦芽糖0.100克，溶于少量蒸馏水中，仔细移入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容到100ml。 （5）0.4M NaOH 操作步骤： （1）酶液的制备： 称取2克萌发的小麦种子，置于研钵中加少量石英砂研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，混均后在室温下放置，每隔数分钟震荡一次，提取15-20分钟，离心，取出上清液备用。 （2）α－淀粉酶活性的测定： 1） 取试管4支，注明两支为对照管，两支为测定管。 2） 于每个管中各加入酶提取液1毫升，在70℃恒温水浴中（水浴温度的变化不应超过±0.5℃）准备加热15分钟，在此期间β—淀粉酶钝化，取出后迅速在水浴中彻底冷却 3） 在试管中各加入1mlpH5.6柠檬酸缓冲液 4） 向两支对照管中各加入4ml0.4MNaOH，以钝化酶的活性 5） 将测定管和对照管置于40℃（±0.5℃）恒温水浴中准确保温15分钟，再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5分钟后取出，向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4NaOH，以终止酶的活性，然后准备下步糖的测定。 （3）α-及β-淀粉酶总活性的测定： 取上述酶液5毫升，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度（稀释倍数是样品酶活性的大小而定，一般为20倍）。混均后，取4支试管，2支为对照管，2支为测定管，各加入稀释后酶液1毫升及pH5.6柠檬酸缓冲液1毫升，以下步骤重复α－淀粉酶测定的第（4）及第（5）的操作。 （4）麦芽糖的测定： 1） 标准曲线的制作