HMG1在PRRSV感染中的作用及Glycyrrhizin抗PRRSV活性研究.docx

HMGBI在PRRSV感染中的作用及Glycyrrhizin抗PRRSV活性研究目 HMGBI在PRRSV感染中的作用及Glycyrrhizin抗PRRSV活性研究 目 录 摘 要 ．．i Abstract．． ．． ． ． ． ． ． ．． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． iii 缩略语表(Abbreviation) vi 1文献综述． 1 1．1 HMGBl的研究进展 ．1 1．1．1高迁移率族蛋白家族 ．1 1．1．2 HMGBl的释放 2 1．1．3 HMGB 1的受体及信号转导 3 1．1．4 HMGBl与炎症反应 5 1．1．5 HMGBl在病毒性传染病中的潜在作用 ．10 1．1．6 HMGBl作为炎症和自身免疫疾病的生物标志 ．12 1．1．7 HMGBl作为疾病治疗的靶标 ．13 1．2猪繁殖与呼吸综合征研究进展 ．15 1．2．1 PRRSV与炎症反应 一15 1．2．2 PRRSV的疫苗 ．．15 1．2．3 PRRSV的复制周期 ．．16 1．3甘草酸与抗病毒 ．17 2研究目的与意义 19 3材料与方法 20 3．1试验材料 ．20 3．1．1实验动物 20 3．1．2细胞、毒株与菌株 20 3．1．3载体与质粒 20 3．1．4工具酶、siRNA及主要试剂 21 3．1．5 Western blot所需材料 22 3．1．6培养基与抗生素及其配制 23 3．1．7主要缓冲液与相关试剂及其配制 24 3．1．8主要实验仪器及设备 26 3．1．9分子生物学分析软件 26 3．2试验方法 ．．26 3．2．1原代PAM细胞的分离 ．26 3．2．2 PRRSV的增殖 ．．27 万方数据 华中农业大学2014届博士研究生学位论文3．2．3病毒滴度的测定 华中农业大学2014届博士研究生学位论文 3．2．3病毒滴度的测定 27 3．2．4 siRNA及质粒转染(脂质体介导的瞬时转染法) 28 3．2．5 Western blot样品制备 28 3．2．6 I斟A的提取及mRNA水平检测 ．．28 3．2．7绝对荧光定量检测PRRSV负链RNA 30 3．2．8 MTS法检测细胞活性 3 1 3．2．9乳酸脱氢酶释放试验 32 3．2．10 ELISA检测细胞因子表达量 一32 3．2．11双荧光素酶报告实验 ．．32 3．2．12间接免疫荧光实验 32 3．2．13酵母双杂交筛选互作蛋白 ．．33 3．2．14动物试验 一34 3．2．15统计学方法 ．．35 4结果与分析 36 4．1 PRRSV感染仔猪后HMGBl的表达升高 ．36 4．1．1 PRRSV感染仔猪后的临床症状及病理变化 36 4．1．2 PRRSV感染仔猪后血清中病毒含量的变化 39 4．1．3 PRRSV感染仔猪后血清中HMGBl的水平升高 40 4．1．4血清中HMGBl的表达与其他炎症因子具有相关性 41 4．1．5 PRRSV感染仔猪后脑、肺和BALF中HMGBl的表达水平升高 42 4．2体外试验发现PRRSV感染诱导HMGBl释放能增强炎症因子的产生 43 4．2．1 PRRSV感染对HMGBl的影响 43 4．2．2 HMGBl对PRRSV的增殖无明显影响 48 4．2．3 HMGBl增强PRRSV诱导的NF．KB的激活和炎症因子的产生 ．．53 4．2．4 RAGE／TLR2／TLR4参与PRRSV诱导的炎症反应 ．57 4．3 Glycyrrhizin对PRRSV增殖的抑制效果 ．．59 4．3．1 Glycyrrhizin对MARC．145细胞和PAM细胞的毒性检测 59 4．3．2 Glycyrrhizin抑制PRRSV在MARC．145细胞中增殖 60 4．3．3 Glycyrrhizin抑制PRRSV在PAM细胞中增殖 ．．61 4．3．4 Glycyrrhizin抑制PRRSV增殖的机制 62 43．5 Glycyrrhizin对PRRSV诱导的炎症反应的影响 66 4．3．6 Glycyrrhizin对PRRSV体内感染的影响 68 5讨论与结论 71 5．1讨论 ．71 5．1．1 PRRSV感染仔猪对HMGBl表达的影响 71 II 万方数据 HMGBl在PRRSV感染中的作用及Glycyrrhizin抗PRRSV活性研究5．1．2 HMGBl在PRRSV感染中的作用及Glycyrrhizin抗PRRSV活性研究 5．1．2 PRRSV体外感染对HMGBl的影响 ．．72 5．1．3 HMGB 1对PRRSV增殖的影响 ．．74 5．1．4 HMGBl对PRRSV诱导炎症反应的影响 ．．74 5．1．5 Glycyrrhizin对PRRSV增殖的影响 76 5．