ANKRD3与长非编码RNAAK004293对肌细胞分化相关基因的表达调控.docx

优秀毕业论文 精品参考文献资料 华农业大学2016 华农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 1．5应用的生物信息学网站及分析软件 ．17 1．6载体 ．1 8 2试验方法 19 2．1细胞培养 ．19 2．1．1细胞的复苏 ．．19 2．1．2 C2C12细胞的增殖培养 19 2．1．3 C2C12细胞的分化培养 19 2．1．4细胞的冻存 ．．20 2．2 C2C12细胞总RNA的提取和cDNA的制备 20 2．3 AK004293超表达载体的构建 21 2．3．1小鼠AK004293 cDNA的克隆 2l 2．3．2琼脂糖凝胶电泳和成像 ．．23 2．3．3 PCR产物的胶回收和克隆测序 ．．23 2．3．4质粒提取 ．．25 2．3．5 pcDNA3．1一AK004293真核表达载体的酶切鉴定 ．25 2．4 ANKRD23超表达载体的构建 25 2．5 AK004293．siRNA干涉片段的选取 26 2．6脂质体介导的细胞转染(6孔板) 26 2．7 Quantitative real．time PCR分析 ．．27 2．8 Western blotting分析 ．28 2．8．1蛋白提取 28 2．8．2 BCA蛋白浓度测定 ．．28 2．8．3 SDS．PAGE电泳 ．28 2．8．4转膜 ．．29 2．8．5封闭 29 2．8．6免疫反应 29 2．8．7 ECL化学发光检测 ．．29 第四章结果与分析 31 1 ANKRD23与AK004293在成肌细胞分化过程中的表达变化 ．．3 1 II 万方数据 ANKRD23与长非编码 ANKRD23与长非编码RNA--AK004293对肌细胞分化相关基因的表达调控 1．1 RNA水平的表达变化 3l 1．2蛋白水平的表达变化 31 2 AK004293的干扰片段筛选 ．．32 3 siRNA对AK004293基因的干扰效果及其对肌细胞分化标志基因表达的影响 33 4 pcDNA3．1．AK004293载体构建及其对肌细胞分化标志基因表达的影响 34 4．1 AK004293超表达载体的鉴定 34 4．2超表达AK004293后肌细胞分化标志基因表达量的变化 34 5 siRNA对ANKRD23基因的干扰效果及及其对肌细胞分化标志基因表达的影响36 6 pcDNA3．1．ANKRD23载体构建及其对肌细胞分化标志基因表达的影响 ．．38 6．1 ANKRD23超表达载体的鉴定 ．．38 6．2超表达ANKRD23后肌细胞分化标志基因表达量的变化 38 第五章讨论 ．40 1关于ANKRD23及与其3’UTR重叠的IncRNAAK004293之间的关系 40 2关于RNAi技术 41 3关于干扰和超表达ANKRD23对成肌细胞分化的影响 4l 4下一步计划 42 d、 结 ．43 参考文献 44 致谢 5 l ⅡI 万方数据 ANKRD23与长非编码 ANKRD23与长非编码RNA--AK004293对肌细胞分化相关基因的表达调控 摘要 肌纤维形成是一个复杂过程，受到多种蛋白编码基因和非编码RNA的精细调 控。在本实验室前期研究结果基础上，我们获得了一个在骨骼肌高表达的 lncRNA．AK004293，该IncRNA与ANKRD23基因3’UTR重叠。本研究利用RNA 干扰技术和超表达技术在C2C12成肌细胞中研究了lncRNA．AK004293对ANKRD23 表达的影响，以及这两个基因对肌细胞分化相关基因表达的影响。主要研究结果如 下： 1．采用实时定量PCR、Western blotting技术检测了超表达和干涉AK004293基 因后肌细胞分化相关基因MyoD、MyoG和MyHC的表达变化及ANKRD23的表达 变化；发现了AK004293对肌细胞分化相关基因与ANKRD23的表达都没有显著影 响。 2．采用实时定量PCR、Westem blotting技术检测了超表达和干涉ANKRD23 基因后肌细胞分化相关基因MyoD、MyoG和MyHC的表达变化；发现干涉 ANKRD23后增强了MyoD、MyoG和MyHC的表达，超表达ANKRD23后减弱了 上述基因的表达，表明ANKRD23对肌细胞分化有负调节作用。 本研究结果为进一步研究肌细胞中ANKRD23的功能及其调控机制奠定了基 础。 关键词：长非编码I斟A；ANKRD23成肌细胞分化；I斟Ai；超表达 万方数据 华农业大学2016 华农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 Abstract Muscle fiber formation is a complex process and subject to fine regulation of a variety